Procedimentos cirúrgicos e metodologia para um modelo de murina pré-clínica de<em> De Novo</em> Metástase do câncer mamário
Summary
Não faltam modelos pré-clínicos que avaliam a terapia adjuvante visando metástases de câncer de mama. Para abordar isso, desenvolvemos um modelo murino de metástase de adenocarcinoma mamário pulmonar de novo , em que as terapias administradas na configuração adjuvante (ressecção pós-cirúrgica de tumores primários) podem ser avaliadas quanto à eficácia no impacto de metástases pulmonares previamente semeadas.
Abstract
A rate-limiting aspect of transgenic mouse models of mammary adenocarcinoma is that primary tumor burden in mammary tissue typically defines study end-points. Thus, studies focused on elucidating mechanisms of late-stage de novo metastasis are compromised, as are studies examining efficacy of anti-cancer therapies targeting mediators of metastasis in the adjuvant setting. Numerous murine mammary cancer models have been developed via targeted expression of dominant oncoproteins to mammary epithelial cells yielding models variably mimicking histopathologic and transcriptome-defined breast cancer subtypes common in women1. While much has been learned regarding the biology of mammary carcinogenesis with these models, their utility in identifying molecules regulating growth of late-stage metastasis are compromised as mice are typically euthanized at earlier time points due to significant primary tumor burden. Moreover, since a significant percentage of women diagnosed with breast cancer receive adjuvant therapy after surgical resection of primary tumors and prior to presence of detectable metastatic disease, preclinical models of de novo metastasis are urgently needed as platforms to evaluate new therapies aimed at targeting metastatic foci. To address these deficiencies, we developed a murine model of de novo mammary cancer metastasis, wherein primary mammary tumors are surgically resected, and metastatic foci subsequently develop over a 115 day post-surgical period. This long latency provides a tractable model to identify functionally significant regulators of metastatic progression in mice lacking primary tumor, as well as a model to evaluate preclinical therapeutic efficacy of agents aimed at blocking functionally significant molecules aiding metastatic tumor survival and growth.
Introduction
As mulheres na América do Norte têm um risco de vida de até 12% de desenvolver câncer de mama 2 ; A maioria destes indivíduos terá tumores primários removidos por cirurgia e, dependendo do subtipo de câncer, receberá terapia direcionada, endócrina, quimioterapia e / ou radioterapia na configuração adjuvante 3 . Exemplos incluem, mulheres diagnosticadas com câncer de receptores hormonais positivos que recebem terapias anti-estrogênio e mulheres com tumores HER2-positivos que recebem terapias direcionadas a HER2 com radiação / quimioterapia, enquanto que não há terapias direcionadas ainda disponíveis para tumores triplos negativos 3 . Apesar dos avanços em terapias de radiação, quimioterapia, terapias hormonais personalizadas que complementam a ressecção cirúrgica, a doença se repete em 30-70% das mulheres diagnosticadas com doença do estágio II ou III 4 , pois as terapias são em grande parte ineficazes na erradicação da doença metastática em órgãos distantes, inclusive Pulmão, osso, bChuva e / ou fígado 5 . Isto é especialmente significativo dado que, quando a doença metastática ocorre na ausência de rebrota primária do tumor, isso implica que as células malignas disseminadas provavelmente já estão presentes nos órgãos secundários no momento da cirurgia definitiva. Assim, as terapias capazes de erradicar ou retardar o crescimento de tumores metastáticos são urgentemente necessárias.
Enquanto de novo modelos de ratinho de cancro mamário têm sido notavelmente informativo em revelar os mecanismos que regulam a progressão neoplásica 1, os modelos existentes também têm várias limitações. Um deles é o fato de que os modelos transgênicos de novo tipicamente desenvolvem tumores primários em múltiplas glândulas mamárias, em que a carga tumoral primária limita a duração dos estudos. Enquanto a fuga de células tumorais primárias e a amadurecimento metastático provavelmente ocorrem precocemente na progressão neoplásica nestes modelos, o desenvolvimento franco de tumores metastáticos ocorre tarde e dependendo deNo modelo do mouse e no fundo da tensão, muitas vezes é parcialmente penetrante 1 . Isto limita ainda mais a utilidade de modelos de novo para a descoberta de moléculas que regulam a metástase em órgãos secundários e para avaliar a eficácia pré-clínica da terapêutica no ambiente adjuvante.
Para contornar essas limitações, desenvolvemos um modelo autônomo de novo de metástase de carcinoma mamário em pulmões. As fêmeas transgênicas parentais ( isto é , MMTV-PyMT no fundo da cepa FVB / n para os estudos aqui descritos) que levam tumores mamários de novo em estágio de novo são envelhecidos para ~ 100 dias 6 , altura em que seus tumores primários são ressecados cirurgicamente e se dissociaram enzimaticamente Suspensões de célula única. As suspensões (1 x 10 6 células) são, por sua vez, explotadas ortotópicamente em camundongos singênicos receptores de 6-7 semanas de idade, onde os tumores mamários primários isolados se desenvolvem ao longo de um período de 38 a 60 dias ( <stronG class = "xfig"> Figura 1A). Num tamanho do tumor definida (172-450 mm3), os ratinhos receptores são anestesiados e tumores primários são cirurgicamente ressecado de tal modo que o crescimento do tumor no local da cirurgia é minimizado, consistente com a cirurgia em mulheres (Recurso Figura 1). No fundo da tensão FVB / n, os camundongos desenvolvem focos metastáticos histologicamente detectáveis em pulmões com 45% de penetrância por ~ 115 dias após a cirurgia ( Figura 1B ). Com esta latência prolongada de crescimento de tumores metastáticos, o modelo está em posição única para a administração de terapia adjuvante e para elucidar e avaliar a biologia subjacente que influencia a progressão metastática após a remoção cirúrgica de tumores primários.
Protocol
Representative Results
Discussion
Modificações e solução de problemas:
Quando o tumor dissecante contundente longe da parede abdominal, o tumor pode permanecer aderente à parede abdominal. Isto foi observado em <5% de ratinhos injetados com tumor (dados não apresentados). Para camundongos com tumores aderentes à parede abdominal, o mouse deve ser eutanásico, pois a ressecção é difícil sem recriação tumoral primária.
Limitações do modelo / técnica:</st…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem a Jo Hill por assistência de histopatologia, o Dr. John Gleysteen para instrução em técnica cirúrgica, Tessa Diebel para assistência em videografia, todos os membros dos laboratórios de Wong e Coussens para insights críticos e discussões, e OHSU Knight Cancer Institute para apoio financeiro. Os autores reconhecem o apoio de T32GM071388-10 e T32CA106195-11 para CEG, o NCI / NIH, o Departamento de Defesa do Programa de Pesquisa sobre o Câncer de Mama, a Fundação Susan G Komen, a Fundação de Pesquisa sobre o Câncer de Mama e uma Fundação Stand Up To Cancer – Lustgarten Subvenção de Pesquisa Translacional da Equipe de Sonhos de Convergência de Câncer de Pâncreas (SU2C-AACR-DT14-14) para a LMC, um Prêmio da Fundação de Doação Feminina da MHW e o Centro Brenden-Colson para Saúde do Pâncreas para MHW e LMC.
Materials
| Isofluorane | Piramal Healthcare | N/A | Prescription order |
| Collagenase A | Roche | 11088793001 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| DMEM | ThermoFisher | 12634010 | |
| 25 mL Pyrex bottle | Sigma-Aldrich | CLS139525 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Bio | S11150 | |
| 0.7 µm nylon strainer | Corning | 352350 | |
| 50 mL conical tube | VWR | 89039-658 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Growth factor-reduced Matrigel | BD | 354230 | Growth factor-reduced solubilized basement membrane preparation extracted from the Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma |
| Poly(vinylpyrrolidone)–Iodine complex | Sigma-Aldrich | PVP1 | |
| 29 gauge 0.3 mL insulin syringe | BD | 324702 | |
| Small Vessel Cauterizer Kit | FST | 18000-00 | |
| Wound clips | Texas Scientific | 205016 | |
| AutoClip wound clip applier | BD | 427630 | |
| AutoClip wound clip remover | BD | 427637 | |
| Bromodeoxyuridine | Roche | 10280879 | |
| Heparinized capillary tubes | Fisher | 22362566 | |
| Microtainer tubes with dipotassium EDTA | BD | 365974 | |
| 20 mL syringe | BD | 309661 | |
| DPBS | Thermo-Fisher | 14190-250 | |
| OCT-freezing medium | VWR | 25608930 | |
| Formalin, Buffered, 10% (Phosphate Buffer) | Fisher | SF100-4 | |
| 23g needle | Fisher | 14-826-6B | |
| FVB/n mouse | Jackson Laboratories | 001800 |
References
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- Howlader, N. N. A., Krapcho, M. . SEER Cancer Statistics Review 1975-2008. , (2011).
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