Dynamic nuclear polarization with subsequent sample dissolution has enabled real-time studies of metabolism in biological systems. Hyperpolarized [1-13C]pyruvate was used to study lactate dehydrogenase activity in a prostate carcinoma cell line in vitro.
Geçmiş yıllarda, tümör evresi, yeniden değerlendirilmesinde, tedaviye yanıt izleme ve çeşitli kanserlerin nüks tespiti için yeni yöntemler 18 F-florodeoksiglukoz ([18 F ile state-of-the-art pozitron emisyon tomografisi ile birlikte ortaya çıkmıştır ] -FDG PET). 13C manyetik rezonans spektroskopi görüntüleme (13 CMRSI) in vivo ve gerçek zamanlı olarak metabolizma izlenmesini sağlayan bir minimal invaziv bir görüntüleme yöntemidir. 13C nükleer manyetik rezonans (NMR) göre herhangi bir başka yöntemle gibi, bu da 13 ° C ve düşük doğal bolluğu nispeten düşük dönermıknatıslık oranda düşük ısı polarizasyon ve daha sonraki bir düşük sinyal-gürültü oranının bir zorlukla karşı karşıya biyolojik örnekler. Bu sınırlamaları aşarak, daha sonraki numune çözünme ile dinamik nükleer polarizasyon (DNP) son zamanlarda yaygın olarak etkin ölçmek için NMR ve manyetik rezonans görüntüleme (MRG) sistemlerinde kullandıÇeşitli biyolojik sistemlerdeki çalışma ve görüntü anahtar metabolik yollar. 13 CMRSI kullanılan özellikle ilginç ve gelecek vaat eden bir molekül, son on yıl içinde, çok daha yakın in vitro klinik öncesi ve kullanılmaktadır, [1- 13 C] piruvat, hücresel enerji metabolizmasını araştırmak için klinik çalışmalarında araştırılmaktadır kanser ve diğer hastalıklar. Bu yazıda, bir 3.35 T preklinik DNP hyperpolarizer kullanarak çözünme DNP tekniğini anahat ve in vitro çalışmalarda kullanımını göstermektedir. Hiperpolarizasyon için benzer bir protokol hem de in vivo çalışmalarda çoğunlukla uygulanabilir. Bunu yapmak için, laktat dehidrojenaz (LDH) kullanılmış ve 13 CMRSI ile bir prostat karsinoma hücre hattı [1- 13 C] laktat, PC3, in vitro [1- 13C] piruvat metabolik reaksiyonu katalize.
Halen, kanser geniş bir yelpazede tümör evrelemesinde, yeniden değerlendirilmesinde, tedaviye yanıt izleme ve nüks tespiti için en yaygın olarak kullanılan klinik yöntem [18F] -FDG PET olduğunu. 1 Ancak, son zamanlarda, çeşitli roman ve alternatif yaklaşımlar ortaya çıkmıştır. Bu yöntemlerden biri de 13 CMRSI olduğunu. Bu teknik, in vitro ya da gerçek zamanlı olarak in vivo metabolizma değerlendirmek için minimal invaziv MRI ardından, bir biyolojik numune içinde 13C-molekülünün giriş kapsar. Bununla birlikte, böyle [18F] -FDG PET veya bilgisayarlı tomografi gibi diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında 13 CMRSI en büyük zorluk, düşük sinyal-gürültü oranıdır.
NMR sinyali polarizasyon seviyesi, toplam nüfus iki enerji Devletleri sıkma yarım çekirdekler nüfus değişimi bir oranı (Şekil 1A) ile doğru orantılıdır. Polarizasyon th ürünü olançekirdeklerin e dönermıknatıslık oranı (γ) ve sıcaklık üzerine uygulanan manyetik alan şiddeti. 1H çekirdeklerinin Tipik bir polarizasyon nispeten düşük bir sinyal-gürültü oranı veren 3 T, 0.001%,% 0.005 kadar düzenindedir. Bugünün state-of-the-art MR nedeniyle sadece biyolojik numunelerde 1 H yüksek bolluk ve 1 H yüksek dönermıknatıslık oranı başarılı bir görüntüleme yöntemi olmuştur (y olan 1H = 42,576 MHz / T). Ancak, karbon gibi diğer çekirdekler, gözlemleyerek daha talep ediyor. Sadece kararlı, manyetik etki karbon izotop, 13C, tüm karbon atomlarının% 1,1 oluşturur. Buna ek olarak, 13 ° C (γ 13C = 10,705 MHz / T) dönermıknatıslık oranı daha düşük bir algılama verimliliği yol 1 H dört kat daha düşüktür. Özetle, düşük 13C bolluğu ve düşük γ 13C termal 13 C ölçümleri 1 hassasiyeti 0,0176% elde etmek için nedenIn vivo 'H-NMR ölçümü.
Dinamik Nükleer Polarizasyon
13 C ölçümlerinin nispeten zayıf duyarlılığı aşmak için bir yöntem DNP olduğunu. Başlangıçta Albert W. Overhauser tarafından 1953 yılında metal tanımlanmıştır. Yazısında, o şöyle demiştir: "iletim elektronlarının elektron spin rezonans doymuş ise, çekirdekler kendi dönermıknatıslık oranı elektron spin o olsaydı onlar olurdu aynı derecede polarize olacağı gösterilmiştir." 2 Sonra o yıl, Carver ve Slichter deneysel Overhauser hipotezini 3 doğruladı. 1958 yılında, Abragam ve Proctor sıvılardaki elektronlar için bu etkiyi tarif ve adını "katı etkisi." 4 K altındaki sıcaklıklarda, elektron spin polarizasyon yaklaşık% 100'e ulaştığında ve nükleer spin polarizasyon (Şekil 1B) 4 daha yüksek büyüklükte fazla üç emir olduğunu. Telektronun dönermıknatıslık oranı (y e = 28024,944 MHz / T) nükleer dönermıknatıslık oranları daha yüksek büyüklükte üç emir olduğu için onun oluşur. Elektron ilgili elektron yakın bir frekans ile, mikrodalga ışıma altında nükleer spin spin böyle Overhauser etkisi, katı etkisi, çapraz etkisi ve termal karıştırma etkisi elektron ve çekirdekler arasındaki zayıf etkileşimler, polarizasyon transferine izin paramanyetik rezonans (EPR) frekans 5,6. DNP teorisi daha fazla elektron ve termal karıştırma dahil etmek için geliştirilmiştir. Bununla birlikte, bugüne kadar, DNP hiçbir birleşik kantitatif teorik açıklama 7,8 yayımlanmıştır.
Şekil 1: Dinamik Nükleer Polarizasyon ve hiperpolarizasyona anlama. Spin nüfusunun) şematik bir karşılaştırmasıTermal denge polarizasyon devlet ve hyperpolarized devlet. B) bir polarizasyon sıcaklığına bağlıdır. Bir elektron polarizasyonu (e -) 1.4 K. DNP altında% 100 10 5 kat kadar onların kutuplaşmayı arttırır 13 C çekirdeklere E- gelen kutuplaşma transferini sağlar ulaşır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
13C NMR kullanılarak biyolojik sistemlerin çalışmalarında DNP tanıtmak için, daha sonraki hızlı numune çözünme geliştirilmeye vardı. 50 yıl Overhauser hipotezi, Jan H. Ardenkjaer-Larsen ve ark sonra. Minimal hiperpolarizasyon kaybı 6 ile sıvı haline hiperpolarize dondurulmuş örnek getirme teknik açıdan zor sorunu çözüldü. Çözünme DNP yeni bir araştırma alanı 13 CMRS denilen açıldıBen, araştırmak ve çeşitli hastalık durumları 9,10 karakterize etmek için yeni bir yöntem sağlar. çiftlenmemiş elektronun, bir tritil radikal tris (8-karboksi-2,2,6,6-tetra (hidroksietil) benzopiran [1,2-4,5] bis- (1,3) olarak stabil taşıyıcılar -dithiole-4-il) -metil sodyum tuzu (OX063) ya da (2,2,6,6-tetrametilpiperidin-1-il) oksil (TEMPO), genellikle kullanılır. Bu arzu edilen 13 C-etiketli molekül ile karıştırıldı ve buna tekabül eden EPR frekansına yakın bir frekans ile mikrodalga ışımasına maruz kalmaktadır. Bu tekniği kullanarak, 13 C çekirdeklerin kutuplaşma% 37 11 kadar artırılabilir. Bu, termal denge polarizasyon 11,12 kıyasla 10 5 kat bir polarizasyon gelişmesine yarar. Ancak, mikrodalga ışınlama durdurulur ve / veya 13 C-molekül sıvı halde aktarılır en kısa sürede, polarizasyon polarize edilmiş 13C çekirdeğinin uzunlamasına gevşeme zamanı (T 1) ile bozunur. BöyleceHızlı çözünme teknikleri icat veya biyolojik uygulamalar 13 için çok önemlidir deneysel ölçüm (yani, enjeksiyon) önce süresini kısaltarak sonraki tekniği.
Aday molekülü başarılı 13 CMRSI çalışmaları için yerine getirmek için gereken üç önemli gereksinimleri vardır. İlk olarak, ilgilenilen 13C çekirdeği yeterince uzun bir T 1 (> 10 s) sahip olmalıdır. 13C-etiketin seçimi çok önemlidir. En iyi aday çekirdekleri bir bağ vasıtasıyla 1H-çekirdekleri ile doğrudan temas karbonlar vardır. Orijinal maddeden önemli ölçüde farklı bir kimyasal kayma ile alt baş metabolik ürün elde 3 T 1 kez – aynı zamanda hızlı bir şekilde 2 metabolize edilmesi gerekmektedir. Alansal dağılımı elektron ve 13 ° C arasındaki mesafeyi azaltır ve böylece örnek karışımı trans sağlayan bir amorf cam, düz bir halde oluşturmalıdırpolarizasyon ferin. Aday molekülün doğal amorf bir cam meydana gelmez, bu gliserol ya da dimetil sülfoksit 14 kadar yüksek bir camlama madde içinde eriyebilir olması gerekir. Bu şartlar Aday moleküllerin nispeten az sayıda sonuçlanır. Ancak, hatta uygun bir molekülün başarılı keşfinden sonra, hiperpolarizasyon için bir çalışma protokolü gelişmekte 9,14,15 teknik olarak zor olabilir.
36, [2- 13C] pirüvat 37, [1- 13C] etil piruvat 38, [1- 13 C – Son yıllarda, çok sayıda alt-tabakalar gibi [1- 13C] piruvat 12,16 olarak, başarılı bir şekilde polarize olmuş ] laktat 39, [1- 13C] fumarat 40-43, 13 Cı-bikarbonat 36,44,45, [1- 13C] sodyum asetat 43,46 – 49, 13 C-üre 6,36,50,51 , [5- 13C] glutamiNE 15,52,53, [1- 13C] glutamat 53,54, [1- 13C] 2-oksoglutarat 55, [1- 13C] alanin, ve diğer 14,56. Hiperpolarizasyon için özellikle ilgi çekicidir ve yaygın olarak kullanılan alt-tabaka [1- 13C] pirüvat olup. Çok çeşitli hastalıkların 14,17,22 hücresel enerji metabolizmasını araştırmak üzere klinik öncesi çalışmalarda kullanılmıştır. [1 13 C] pirüvat metabolize olan sonradan önce hücre zarından nispeten uzun T 1 ve hızlı ulaşım dahil olmak üzere başarılı hiperpolarizasyon için tüm gereksinimleri karşılamaktadır. [1 13 C] piruvat ile klinik öncesi çalışmalar halen klinikte 57 çevrilmektedir ediliyor.
Piruvat metabolizması
İyi bir kanser hücrelerinin DNA ve onların metabolik yollar değişikliklere mutasyon arasında doğrudan bir bağ var olduğu bilinmektedir. Zaten 1920'lerde, Otto Warburg discov60 – sağlıklı doku 58 göre tümörlerde glikoz ve laktat üretimi metabolizma artışı olduğunu göz önünde bulundurmuştur. Daha sonra, bu, pentoz fosfat yolu, trikarboksilik asit döngüsü ve oksidatif fosforilasyon ve nükleotidler ve lipid sentezleri gibi başka metabolik yol, çeşitli münavebeli tarif edilmiştir.
Piruvat glikolizin nihai ürünü olan. Tümör, bu LDH 61 ile katalize anaerobik glikoliz maruz koenzim nikotinamid adenin dinükleotidin indirgenmiş formu ile reaksiyona (NADH), laktat ve koenzim (NAD +) oksitlenmiş formda elde edilir. Seçenek olarak ise, piruvat transaminaz alanin (ALT) ile katalize alanin oluşturulması için glutamat ile transaminasyon reaksiyonu maruz kalır. Her iki reaksiyon kolayca geri dönüşümlüdür. Piruvat, aynı zamanda, karbon dioksit ve asetil-CoA'nın, R, piruvat dehidrogenaz (PDH) ile katalize dekarboksilasyonu maruzBu aşamada geri dönülmez bir şekilde reaksiyon epresenting. Bu reaksiyon oranları Alternations tümör metabolizması 17,21,22,25,62 ile bağlantılı olabilir. Metabolik yollar Şekil 2'de özetlenmiştir.
Şekil 2: piruvat majör metabolik tepkime diyagramı. Piruvat / laktat dönüşüm LDH ile katalize edilir ve pirüvat / alanin dönüşüm ALT ile katalize edilmektedir. Piruvat tersinmez ve PDH CO 2,-asetil CoA'ya dönüştürülmesi ve CO2 bikarbonat 80 olan bir pH değerine bağımlı bir denge halindedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Hiperpolarize [1- 13C] piruvat ve metabolitlerinin tespiti daha önce farede gösterilmiştir Osanat 37,63 – 65, karaciğer 66, kas ve böbrek 62,67. Bir çalışmada, normal ve aç bırakılmış sıçan karaciğer 66 arasındaki laktat-alanine-oranında önemli farklılıklar gösterdi ve karaciğer kanseri 68,69 bir yüksek yükseltilmiş ve hiperpolarize [1- 13C] laktat düzeyi sergilemiştir. Tümör derecesi eksize tümörlerin histolojik grade ile yüksek korelasyon gösteren hyperpolarized laktat düzeyleri ile, hiperpolarize [1- 13 C] piruvat 22 kullanarak fare prostat (TRAMP) bir transgenik adenokarsinomaya tespit edilebilir olduğuna dair kanıtlar vardır. Alt ile piruvattan katalize alanin sıçan karaciğer kanseri 23 yararlı bir marker olarak önerilmiştir.
Piruvat-laktat metabolik akı ölçümü, izlenmesi iskemi 63,65,70 ve sitotoksik kemoterapi 17,40, hedeflenen ilaç tedavisine yanıt olarak kullanılmıştır <destek> 24,25,41 ya da hayvan modellerinde, radyoterapi 26. Ayrıca, glioblastoma ve meme kanseri fare modellerinde 25 fosfatidilinositol 3-kinaz (PI3K) inhibitörü LY294002 yanıtının saptanması için kullanılmıştır. Beyindeki piruvat metabolizması değişiklikleri 26 ve prostat kanseri 24,71, aynı zamanda tedaviden sonra gözlenmiştir tümörler.
prostat Kanseri
Prostat kanseri tüm dünyada 72 erkeklerde ölüme bağlı yaşlı erkek ve ikinci lider kanser baskın kanser türüdür. Bugüne kadar hiçbir güvenilir, non-invaziv yöntemler sıkı algılama ve hastaların evreleme sağlamak için yeni metabolik görüntüleme teknikleri için acil ihtiyaç vurgulayan prostat kanseri 73,74 erken tanı ve karakterizasyonu için kullanılabilir. Prostat kanseri hastada 13 CMRSI ile birlikte çözünme DNP olanaklarını göstermek için bir model olarak kullanıldı57 s. Bu çalışma, prostat kanseri görüntüleme için bir ilk klinik istihdam deneme [1- 13 C] piruvat ve 13 CMRSI devam edildi ve sadece son zamanlarda (NCT01229618) tamamlandı gelmiştir.
Bu çalışmanın arkasındaki motivasyon hücreleri ile bir preklinik ortamda 13 CMRSI yönteminin uygulanması daha detaylı ve daha geniş bir kitleye için göstermek için idi. PC3 prostat karsinomlu hücre çizgisi in vitro [1- 13C] laktata [1- 13C] piruvat LDH katalize metabolizma Ölçüm, in vitro çalışmalarda çözünme DNP olası uygulanabilirliğini ve önemli adımlar adres ve deneyler sırasında zorluklar.
13CMRSI with hyperpolarized probes is a promising method to monitor metabolism in real time in vitro and in vivo. One very important aspect when employing this experimental process is the proper standardization, especially regarding in vitro experiments. First, the preparation of the sample needs to be done properly and consistently to achieve the same concentration of hyperpolarized material in each experiment. This requires a precise weighing of both the sample to be hyperpolarized…
The authors have nothing to disclose.
E.K. gratefully acknowledges the support of the Graduate School of Bioengineering (GSB) at Technische Universität München. This work was supported by the German Research Foundation (DFG) within the SFB Collaborative Research Center 824, “Imaging for Selection, Monitoring, and Individualization of Cancer Therapies.”
HyperSense DNP Polariser | Oxford Instruments | 3.35 T preclinical DNP hyperpolarizer | |
GE/Agilent MR901 | GE Healthcare/Agilent Technologies | 7 T preclinical MRI scanner, with small bore designed for experiments onrodent | |
Spinsolve Carbon | Magritek | 1 T NMR spectrometer with permanent magnet | |
Deuterium Oxide | Sigma Aldrich | 7789-20-0 | |
Sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | 7558-79-4 | |
Sodium phosphate monbasic | Sigma Aldrich | 7558-80-7 | |
Sodium hydroxide | Sigma Aldrich | 1310-73-2 | |
Disodium edetate | Sigma Aldrich | 6381-92-6 | |
Pyruvic acid – 13C1 | Cambridge Isotopes Laboratories | CLM-8077-1 | |
Dotarem (0.5 mmol/L) | Guerbet | gadoterate meglumine | |
tris (8-carboxy-2,2,6,6-tetra-(hydroxyethyl)-benzo-[1,2–4,5]-bis-(1,3)-dithiole-4-yl)-methyl sodium salt (OX063) | GE Healthcare | trityl radical used as a sourse of free electron | |
PC3 cell line | ATCC | CRL1435 | |
F-12K medium | ATCC | 30-2004 | |
Fetal Bovine Serum | ATCC | SCRR-30-2020 | |
Trypsine-EDTA Solution, 1X | ATCC | 30-2101 | |
Sample plastic cup | Oxford Instruments | ||
Trypan blue | Bio-Rad | 145-0013-MSDS |