과분극⁽¹³⁾ C 대사 자기 공명 분광학 및 이미징

Summary

Dynamic nuclear polarization with subsequent sample dissolution has enabled real-time studies of metabolism in biological systems. Hyperpolarized [1-¹³C]pyruvate was used to study lactate dehydrogenase activity in a prostate carcinoma cell line in vitro.

Abstract

지난 수십 년 동안, 종양의 병기, restaging, 치료 반응 모니터링 및 암의 다양한 재발 검출을위한 새로운 방법 ⁽¹⁸⁾ F-fluorodeoxyglucose ^([(18) F와 최첨단 양전자 방출 단층 촬영과 함께 등장 ] -FDG PET). ¹³ C 자기 공명 분광 영상 ⁽¹³ CMRSI)은 생체 내에서 실시간으로 대사의 모니터링을 가능하게하는 최소 침습 촬상 방법이다. ¹³ C 핵 자기 공명 (NMR)에 기초하여 임의의 다른 방법으로 인한 ¹³ C 및 낮은 자연 존재비의 비교적 낮은 회전 자기 비에 저열 분극 후속 낮은 신호대 잡음비의 도전에 직면 생물학적 시료. 이러한 한계를 극복하고, 이후 시료 용해 동적 핵 분극 (DNP)는 최근에 일반적으로 사용할 NMR 측정하는 자기 공명 영상 (MRI) 시스템을 사용한다양한 생물학적 시스템의 연구 및 이미지 주요 대사 경로. ¹³ CMRSI에서 사용되는 특히 흥미롭고 유망한 분자는 지난 10 년 동안 널리 최근 시험 관내, 비 임상 및 위해 사용되어왔다 ^[1-13 C] 프로피온산, 세포 에너지 대사를 조사하는 임상 연구이다 암과 다른 질병이다. 이 글에서, 우리는 3.35 T 전임상 DNP의 분극을 사용하여 용해 DNP의 기술 개요 및 시험관 연구에서의 사용을 보여줍니다. 과분극 대해 유사한 프로토콜뿐만 아니라 생체 내 연구의 대부분에 적용될 수있다. 이를 위해, 우리는 락 테이트 탈수소 효소 (LDH)를 사용하고 ¹³ CMRSI를 사용하여 전립선 암 세포주 ^[1-13 C] 락트산 PC3, 시험관 내에서 ^[1-13 C] 피루브산 대사 반응을 촉매.

Introduction

현재, 암의 다양한 종양 스테이징 restaging, 치료 반응 모니터링, 반복 검출을위한 가장 널리 사용되는 방법은 임상 ^[18 F] -FDG PET이다. ⁽¹⁾ 그러나, 최근 여러 소설과 다른 접근 방법이 등장했다. 그 방법 중 하나는 ¹³ CMRSI입니다. 이 방법은 시험 관내에서 또는 실시간으로 생체 내에서 신진 대사를 평가하는 최소 침습 MRI 따르는 생물학적 샘플에 ¹³ C 분자의 도입을 포함한다. 그럼에도 불구하고, 예컨대 ^[18 F] -FDG PET 또는 컴퓨터 단층 촬영 등의 다른 방법에 비해 ¹³ CMRSI의 가장 큰 문제는, 낮은 신호 대 잡음비이다.

핵 자기 공명 신호는 분극 레벨 총인구 두 에너지 상태에서 스핀 ½ 핵 인구 차의 비 (도 1a)에 정비례한다. 편광은 일의 제품입니다핵의 전자 회전 자기 비 (γ) 및 온도에 대한인가 자계 강도. ¹ H 핵의 일반적인 편광은 상대적으로 열악한 신호 대 잡음비를 제공한다 (3) T에서 0.001 % ~ 0.005 %의 순서이다. 오늘날의 최첨단 MRI는 인해 생물학적 시료에서 ¹ H의 높은 풍부 ¹ H의 높은 회전 자기 비율 성공적인 이미징 방법이었다 (γ _1H = 42.576 MHz의 / T). 그러나, 카본과 같은 다른 핵을 관찰하는 것이 더 요구된다. 유일한 안정 자기 활성 탄소 동위 원소, C ^(13)는 모두 탄소수 단지 1.1 %를 차지한다. 또한, ¹³ C (γ = 10.705 MHz의 _13C / T)의 회전 자기 비는 낮은 검출 효율을 초래 ^한 H의 4 배 이하이다. 요약하면, 낮은 ¹³ C 풍부 낮은 γ의 _{13C 열} ¹³ C 측정은 ^하나의 감도 0.0176 %를 달성시킬생체 내에서 H-NMR 측정.

동적 핵 분극

¹³ C 측정의 비교적 불량한 감도를 극복하는 방법은 DNP이다. 그것은 원래 앨버트 W. 오버 하우저 (Overhauser)에 의해 1953 년에 금속에 대해 설명했다. 그 논문에서, 그 명시된 "전도 전자의 전자 스핀 공명이 포화되면, 핵 그들의 회전 자기 비는 전자 스핀의이라면 그들이 것 같은 정도 편파 될 것 ^같다."이 나중에 그 해는 조각가와 Slichter 실험적으로 오버 하우저 (Overhauser)의 가설 ^3을 확인했다. 1958 년, 아브라 감 및 프록터는 액체에서 전자이 효과를 설명하고 그 이름 "고체 효과." 4 K 이하의 온도에서, 전자의 스핀 분극은 거의 100 %에 도달하고 핵 스핀 분극 (도 1b) ^4보다 크기보다 3 명령이다. 티전자의 회전 자기 비 (γ = 28024.944 MHz의 _E / T)는 회전 자기 핵 비율보다 3 자릿수 때문에 자신이 발생한다. 전자가 해당 전자에 가까운 주파수를 갖는 마이크로파 방사선을 이용하여 핵 스핀으로 회전에서 같은 오버 하우저 (Overhauser) 효과, 고체 효과 가교 효과 및 열적 혼합 효과로서, 전자와 원자핵 사이의 약한 상호 작용은 편광의 전송을 허용 상자성 공명 (EPR) 주파수 ^5,6-. DNP의 이론은 더 이상 전자 및 열 혼합을 포함하기 위해 개발되었습니다. 그럼에도 불구하고, 현재까지, DNP의 더 통합 된 양적 이론적 인 설명은 ^{7, 8을} 발표 없습니다.

그림 1 : 동적 핵 분극과 과분극 이해. 스핀 인구 A) 개략적 비교열 평형의 편광 상태와 분극 상태이다. B) 편광은 온도에 따라 달라집니다. 전자의 분극의 (e ^-) 1.4 K이다 DNP 이하 100 % ¹⁰⁵ -fold까지 자신의 편광을 증가 C ¹³ 핵에 전자로부터 편광 전송할 수에 도달한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

¹³ C NMR을 이용하여 생물학적 시스템의 연구에서 DNP을 소개하고, 이후 빠른 샘플 용해 개발했다. 오십년 오버 하우저 (Overhauser)의 가설, 월 H. Ardenkjaer – 라센 등 후. 최소한의 과분극 손실 ⁶ 액체 상태로 분극 냉동 샘플을 가져 오는 기술적으로 어려운 문제를 해결했다. 해산 DNP는 연구의 새로운 분야가 ¹³ CMRS라는 오픈나는, 조사 및 각종 질병 상태 ^{9,10의 특성을} 할 수있는 새로운 방법을 제공한다. 부대 전자, 트리 틸 라디칼 (8- 카르복시 -2,2,6,6- 테트라 (히드 록시 에틸) -benzo- [1,2-4,5] 비스 – (1,3)의 안정된 운반 -dithiole -4- 일) – 메틸 나트륨 염 (OX063) 또는 (2,2,6,6- 테트라 메틸 피 페리 딘 -1- 일) 옥실 (TEMPO)는 일반적으로 사용된다. 이러한 목적 ¹³ C 표지 분자와 혼합하고, 해당 EPR 주파수에 가까운 주파수를 갖는 마이크로파 방사선에 노출된다. 이 기술을 사용하여, ¹³ C 핵의 편광을 37 내지 ¹¹ %까지 증가 될 수있다. 이는 열 평형 편광 ^{(11, 12)에} 비해 ¹⁰⁵ -fold 분극 향상을 초래한다. 그러나, 마이크로파의 조사를 중지 및 / 또는 ¹³ C-분자가 액체 상태로 전송하자마자, 편광은 편광 된 ¹³ C 핵의 종 완화 시간 (T _1)와 붕괴. 따라서,빠른 용해 기술의 발명 또는 생물학적 응용 프로그램 ^(13)에 대한 중요 실험 측정 (즉, 주사)하기 전에 시간을 단축 후속 기술.

후보 분자가 성공적으로 ¹³ CMRSI 연구를 위해 수행해야하는 세 가지 주요 요구 사항이 있습니다. 첫째, 관심있는 ¹³ C 핵은 충분히 긴 T ₁ (> 10 초)을 가지고있다. ¹³ C-라벨의 선택은 매우 중요하다. 가장 좋은 후보 핵 결합을 통해 ¹ H-핵와 직접적인 접촉 탄소입니다. 본래 물질로부터 상당히 상이한 화학 시프트 하류 대사 산물의 생성, T (3) ₁ 회 – 또한 급속이 내 대사되어야한다. 공간 분포가 전자 ¹³ C 사이의 거리를 감소되도록 샘플 혼합물은 트랜스 있도록, 비정질 유리 때 고체 상태를 형성해야편광 남았다. 후보 분자는 자연적으로 비정질 유리를 형성하지 않는 경우, 글리세롤이나 디메틸 설폭 사이드 ^(14)를 고하는 유리처럼 제에 가용성 인 필요가있다. 이러한 요구 사항은 후보 분자의 상대적으로 적은 수의 결과. 그러나, 적합한 분자의 성공적인 검색 후에, 과분극하는 작용 프로토콜을 개발하는 것은 ^9,14,15 기술적으로 어려울 수있다.

³⁶ [2- ⁽¹³⁾ C] 프로피온산 ^(37), [1- ⁽¹³⁾ C] 에틸 피루 베이트 ^{38, [1-13} C ^– 최근, 여러 기판은 ^[1-13 C] 프로피온산 ^{(12, 16)로} 성공적으로 편광왔다 ] 락트 ³⁹ [1- ⁽¹³⁾ C] 푸마 ^{40-43, 13} C-중탄산 ^{36,44,45 [1-13} C] 아세트산 나트륨 ^{43,46 – 49 13} C – 우레아 ^6,36,50,51 , [5- ⁽¹³⁾ C] glutamiNE ^{15,52,53 [1-13} C] 글루타메이트 ^{(53, 54),} [1- ⁽¹³⁾ C] 2- 옥소 글 루타 레이트 ^(55), [1- ⁽¹³⁾ C] 알라닌 등 ^14,56. 과분극을 위해 특히 재미 있고 일반적으로 사용되는 기판은 [1- ⁽¹³⁾ C] 피루브산이다. 널리 각종 질병 ^{14,17,22에서} 세포의 에너지 대사를 조사하기 위해 전임상 연구에 사용된다. ^[1-13 C]는 피루브산은 대사되고이어서 전에 세포막 비교적 긴 T ₁ 및 신속한 전송을 포함 성공적인 과분극의 모든 요건을 만족한다. [1- ⁽¹³⁾ C] 피루 베이트와 전임상 연구는 현재 병원 ^57로 번역되고있다.

피루브산의 대사

또한 암 세포의 DNA 및 대사 경로의 변화 변이 사이에 직접 링크가 존재하는 것으로 알려져있다. 이미 1920 년대에, 오토 바르 부르크의 discov^{60 –} 건강한 조직 ^(58)에 비해 종양에서 포도당과 젖산의 생산의 증가 신진 대사를가 있음을 겹으로. 이어서, 같은 오탄당 포스페이트 경로의 트리 카르 복실 산 사이클 산화 적 인산화 및 뉴클레오타이드 및 지질의 합성 등의 다른 대사 경로에서 다양한 교대가 설명되었다.

피루브산은 해당 작용의 최종 제품입니다. 종양에서, LDH ^(61)에 의해 촉매 무산소을 겪게하고 보효소 니코틴 아미드 아데닌 디 뉴클레오티드 환원 형의 반응 (NADH), 락트산 및 조효소 (NAD ^+)의 산화 된 형태의 결과. 선택적으로, 피루 베이트는 알라닌 트랜스 아미나 제 (ALT)에 의해 촉매를 형성하는 알라닌 글루타메이트와 아미노기 전이 반응을 겪는다. 두 반응은 쉽게 되돌릴 수 있습니다. 피루브산은 이산화탄소 및 아세틸 -CoA, R로 피루 베이트 탈수소 효소 (PDH) 촉매로 탈 카르 복 실화를 겪는이 단계에서의 비가역 반응을 epresenting. 이 반응 속도에 교대 종양 대사 ^{17,21,22,25,62} 연결될 수있다. 대사 경로는 그림 2에 요약되어있다.

그림 2 : 피루브산의 주요 대사 반응의 다이어그램. 피루 베이트 / 락 테이트 변환 LDH에 의해 촉진되고, 피루브산 / 알라닌 변환 ALT 의해 촉매된다. 피루브산은 비가 역적 및 PDH에 의한 CO _2, 닐 -CoA 아세틸 변환 및 CO _2는 수소 나트륨 ^(80)의 pH에 의존 평형에 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

과분극 [1- ⁽¹³⁾ C] 피루브산과 그 대사 산물의 검출은 이전에 쥐에서 증명되었다 그는예술 ^{37,63 – (65),} 간 ^(66), 근육, 신장 ^62,67. 한 연구는 정상 및 금식 쥐의 간 ⁽⁶⁶⁾ 사이의 락 테이트 – 투 – 알라닌 비율에 유의 한 차이를 보여 간암 ^68,69에서 매우 높은 및 과분극 [1- ⁽¹³⁾ C] 젖산 수준을 보여 주었다. 종양 등급이 절제된 종양의 조직 학적 등급과 높은 상관 관계를 나타내는 분극 젖산 수준, 과분극 ^[1-13 C] 프로피온산 ^(22)을 사용하여 마우스 전립선 (TRAMP)의 형질 선암에서 식별 될 수 있다는 증거가있다. ALT에 의해 피루브산에서 촉매 알라닌은 쥐의 간세포 암 ^(23)에 유용한 지표로 제안되었다.

피루 베이트 락 테이트 대사 플럭스를 측정하는 모니터링 허혈 ^63,65,70과 세포 독성 화학 요법 ^17,40 타겟 약물 치료에 대한 응답으로서 사용되고 <SUP> 24,25,41, 또는 동물 모델에서 방사선 치료 ^26. 또한 교 모세포종 및 유방암의 마우스 모델 ^(25)의 포스파티딜 이노시톨 3- 키나제 (PI3K)의 억제제 LY294002 응답의 검출을 위해 사용되었다. 뇌에 피루브산 대사의 변화는 ²⁶ 전립선 암 ^{24,71 또한} 치료 후 관찰되었다 종양이.

전립선 암

전립선 암은 전 세계적으로 ⁷² 남성의 죽음과 관련된 노인 남성과 두 번째 주요 암의 주된 암이다. 현재까지 신뢰성있는 비 침습적 방법은 엄격한 탐지 및 환자의 준비를 가능하게하는 새로운 대사 이미징 기술에 대한 긴급한 필요성을 강조, 전립선 암 ^{73, 74의} 조기 진단 및 특성에 사용할 수 없습니다. 전립선 암 환자 ¹³ CMRSI 결합 용출 DNP의 가능성을 입증하는 모델로 사용 된^57이야. 이 연구는 전립선 암의 촬상하는 제 이용한 임상 시험 ^[1-13 C] 프로피온산 ¹³ CMRSI에서 계속하고, 이는 최근 (NCT01229618)을 완료 하였다.

이 작품 뒤에 동기는 세포와 임상 설정에서 ¹³ CMRSI 방법의 응용 프로그램을보다 상세하고 광범위한 청중에 대해 설명했다. PC3 전립선 암 세포주에서의 시험 관내 ^[1-13 C] 락트산 내지 ^[1-13 C] 프로피온산의 LDH – 촉매 대사를 측정 우리는 시험 관내 연구에서 용해 DNP의 가능한 응용을 설명하고 결정적인 단계를 처리하고 실험 기간 동안 도전.

Protocol

1. 샘플 원액 준비 1 밀리몰 / L GadM의 최종 농도를 농축하여 [1- (13) C] 피루브산으로 가도 테 린산의 메 글루 민 (GadM, 0.5 몰 / L)를 추가한다. 틸 라디칼 (8- 카르복시 -2,2,6,6- 테트라 (히드 록시 에틸) -benzo- [1,2-4,5] 비스 (1,3-) -dithiole -4- 일) – 추가 – 이 혼합물에 메틸 나트륨 염 (OX063)는 15 밀리몰 / L의 최종 농도를 얻었다. 완전히 용해 될 때까지 소용돌이. 참고 :이 원액 준비는 3.35-T …

Representative Results

은 "마이크로파 소인"의 결과는도 3에 도시되어있다. 이는 [1-13 C] 프로피온산 샘플에 대한 최적의 마이크로파 주파수가 로컬 3.35-T의 분극 대 94.156 GHz의 것을 나타낸다. 모든 다음의 실험은 과분극 (N = 14)의 100 mW의 전력이 마이크로파의 주파수를 사용하여 수행 하였다. 마이크로파 조사에 90 %보다 높은 고체 과분극 선도, 60 내지 80 분 동안 적용 하였다. 결과는 그?…

Discussion

과분극 프로브 ¹³ CMRSI 시험 관내 및 생체 내 대사를 실시간으로 모니터링하는 유망한 방법이다. 하나의 매우 중요한 측면이 실험 방법을 사용하는 것이 특히 생체 외 실험에 대해 적절한 표준화이다. 먼저, 시료의 준비 각 실험에서 분극 물질의 동일한 농도를 달성하기 위해 적절하고 일관성있게 수행되어야한다. 이 과분극 버퍼로 샘플 모두의 무게 정확한을 필요로한…

Materials

HyperSense DNP Polariser	Oxford Instruments		3.35 T preclinical DNP hyperpolarizer
GE/Agilent MR901	GE Healthcare/Agilent Technologies		7 T preclinical MRI scanner, with small bore designed for experiments onrodent
Spinsolve Carbon	Magritek		1 T NMR spectrometer with permanent magnet
Deuterium Oxide	Sigma Aldrich	7789-20-0
Sodium phosphate dibasic	Sigma Aldrich	7558-79-4
Sodium phosphate monbasic	Sigma Aldrich	7558-80-7
Sodium hydroxide	Sigma Aldrich	1310-73-2
Disodium edetate	Sigma Aldrich	6381-92-6
Pyruvic acid – 13C1	Cambridge Isotopes Laboratories	CLM-8077-1
Dotarem (0.5 mmol/L)	Guerbet		gadoterate meglumine
tris (8-carboxy-2,2,6,6-tetra-(hydroxyethyl)-benzo-[1,2–4,5]-bis-(1,3)-dithiole-4-yl)-methyl sodium salt (OX063)	GE Healthcare		trityl radical used as a sourse of free electron
PC3 cell line	ATCC	CRL1435
F-12K medium	ATCC	30-2004
Fetal Bovine Serum	ATCC	SCRR-30-2020
Trypsine-EDTA Solution, 1X	ATCC	30-2101
Sample plastic cup	Oxford Instruments
Trypan blue	Bio-Rad	145-0013-MSDS