hyperpolarisé¹³ C Metabolic Magnetic Resonance Spectroscopy and Imaging

Summary

Dynamic nuclear polarization with subsequent sample dissolution has enabled real-time studies of metabolism in biological systems. Hyperpolarized [1-¹³C]pyruvate was used to study lactate dehydrogenase activity in a prostate carcinoma cell line in vitro.

Abstract

Au cours des dernières décennies, de nouvelles méthodes pour la mise en scène de la tumeur, restadification, suivi de la réponse au traitement, et la détection de la récurrence d'une variété de cancers ont vu le jour en collaboration avec la tomographie state-of-the-art la tomographie par émission de ¹⁸ F-fluorodéoxyglucose ^([18 F ] -FDG TEP). ¹³ C résonance magnétique imagerie spectroscopique ⁽¹³ CMRSI) est une méthode d'imagerie mini – invasive qui permet la surveillance du métabolisme in vivo et en temps réel. Comme pour toute autre méthode basée sur ¹³ C résonance magnétique nucléaire (RMN), il fait face au défi de la faible polarisation thermique et un rapport subséquent de faible signal sur bruit en raison de la relativement faible rapport gyromagnétique de ¹³ C et sa faible abondance naturelle des échantillons biologiques. En surmontant ces limitations, la polarisation nucléaire dynamique (DNP) avec échantillon suivant la dissolution a récemment permis couramment utilisé l'imagerie par résonance magnétique (IRM) des systèmes RMN et pour mesurer, L'étude et l'image des voies métaboliques clés dans divers systèmes biologiques. Une molécule particulièrement intéressante et prometteuse utilisée dans ¹³ CMRSI est [1- ¹³ C] pyruvate, qui, au cours des dix dernières années, a été largement utilisé pour in vitro, préclinique, et, plus récemment, des études cliniques pour enquêter sur le métabolisme énergétique cellulaire dans le cancer et d'autres maladies. Dans cet article, nous décrivons la technique de dissolution DNP utilisant un DNP préclinique hyperpolarisation 3,35 T et de démontrer son utilisation dans des études in vitro. Un protocole similaire pour hyperpolarisation peut être appliqué pour la plupart dans les études in vivo aussi bien. Pour ce faire, nous avons utilisé la lactate déshydrogénase (LDH) et catalysé la réaction métabolique de [1- ¹³ C] pyruvate [1- ¹³ C] lactate dans une lignée de cellules de carcinome de la prostate, PC3, in vitro en utilisant ¹³ CMRSI.

Introduction

Actuellement, la méthode clinique la plus largement utilisée pour déterminer le stade de la tumeur, restadification, la surveillance de la réponse au traitement, et la détection de la récurrence d'une grande variété de cancers est de ^[18F] FDG PET. ¹ Toutefois, récemment, plusieurs approches nouvelles et alternatives ont vu le jour. Une de ces méthodes est ¹³ CMRSI. Cette technique implique l'introduction de la ^{13C-molécule} dans un échantillon biologique, suivi par IRM mini – invasive pour évaluer le métabolisme in vitro ou in vivo en temps réel. Néanmoins, le plus grand défi de ¹³ CMRSI, par rapport aux autres méthodes telles que ^[18 F] FDG PET ou tomodensitométrie, est son faible rapport signal à bruit.

Le signal de RMN est directement proportionnel au niveau de polarisation, un rapport de la différence de population de spin ½ noyaux dans deux états d'énergie à la population totale (figure 1A). La polarisation est un produit de the rapport gyromagnétique (en γ) des noyaux et la force du champ magnétique appliqué au-dessus de la température. Une polarisation typique de ¹ pour les noyaux H est de l'ordre de 0,001% à 0,005% à 3 T, ce qui donne un rapport relativement faible rapport signal à bruit. L'IRM state-of-the-art d'aujourd'hui a été une méthode d'imagerie réussie seulement en raison de la forte abondance de ¹ H dans des échantillons biologiques et le rapport gyromagnétique élevé de ¹ H (y _1H = 42,576 MHz / T). Cependant, en observant d'autres noyaux tels que le carbone, est plus exigeante. La seule stable, isotope du carbone actif magnétiquement, ¹³ C, ne représente que 1,1% de tous les atomes de carbone. En outre, le rapport gyromagnétique ¹³ C (γ = 10,705 MHz _13C / T) est quatre fois inférieure à celle du ¹ H, conduisant à une efficacité de détection inférieure. En résumé, la faible abondance ^13C et _13C faible γ provoquent des mesures thermiques ¹³ C pour obtenir 0,0176% de la sensibilité d'un ¹Mesure H-RMN in vivo.

Polarisation nucléaire dynamique

Une méthode pour surmonter la sensibilité relativement médiocre de ¹³ mesures C est DNP. Il a été initialement décrit pour les métaux en 1953 par Albert W. Overhauser. Dans son article, il a déclaré: "Il est démontré que si la résonance de spin électronique des électrons de conduction est saturé, les noyaux seront polarisés au même degré qu'ils seraient si leur rapport gyromagnétique était celle du spin de l' électron." ² plus tard cette année, Carver et Slichter confirmée expérimentalement l'hypothèse de Overhauser ^3. En 1958, Abragam et Proctor décrit cet effet pour les électrons dans les liquides et l'a nommé «l'effet solide." A des températures inférieures à 4 K, électron-polarisation de spin atteint près de 100% et plus de trois ordres de grandeur plus élevé que le spin nucléaire polarisation (figure 1B) ^4. Tson produit parce que le rapport gyromagnétique de l'électron (γ _e = 28,024,944 MHz / T) est de trois ordres de grandeur supérieurs aux ratios gyromagnétiques nucléaires. Les faibles interactions entre les électrons et les noyaux, tels que l'effet Overhauser, l'effet solide, l'effet croisé, et l'effet de mélange thermique, permettent le transfert de polarisation de spins des électrons à spins nucléaires par irradiation micro-ondes avec une fréquence proche de l'électron correspondant la résonance paramagnétique (EPR) fréquence ^5,6. la théorie DNP a été développée pour impliquer davantage les électrons et mélange thermique. Néanmoins, à ce jour, aucune description théorique quantitative unifiée de DNP a été publiée ^7,8.

Figure 1: Comprendre Polarisation Dynamique Nucléaire et Hyperpolarisation. A) Une comparaison schématique de la population de spindans l'état d'équilibre de polarisation thermique et l'état hyperpolarisé. B) La polarisation dépend de la température. La polarisation d'un électron (e ^-) atteint 100% en dessous de 1,4 K. La DNP permet le transfert de la polarisation de l'électronique des ¹³ noyaux de C, ce qui augmente leur polarisation jusqu'à 10 ⁵ -fold. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Pour introduire DNP dans les études sur les systèmes biologiques à l' aide de RMN ¹³ C, à la suite échantillon rapide dissolution a dû être mis au point. 50 ans après l'hypothèse de Overhauser, Jan H. Ardenkjaer-Larsen et al. résolu la question techniquement difficile d'amener l'échantillon congelé hyperpolarisé à l'état liquide avec une perte de hyperpolarisation minimale ^6. Dissolution DNP a ouvert un nouveau champ de recherche appelé ¹³ CMRSI, fournissant une nouvelle méthode pour étudier et de caractériser divers états pathologiques ^9,10. Comme supports stables d'un électron non apparié, un trityle tris radical (8-carboxy-2,2,6,6-tétra (hydroxyéthyl) -benzo- [1,2-4,5] -bis- (1,3) -dithiole-4-yl) -méthyl sel de sodium (OX063) ou (2,2,6,6-tétraméthylpipéridin-1-yl) oxyle (TEMPO) est habituellement utilisé. Ceux – ci sont mélangés avec la ¹³ molécule désirée marqué au C et exposés à un rayonnement micro – ondes à une fréquence proche de la fréquence EPR correspondante. En utilisant cette technique, la polarisation des noyaux de ¹³ C peut être augmentée jusqu'à ¹¹ à 37%. Il en résulte une amélioration de la polarisation -fold 10 ⁵ par rapport à l'équilibre thermique de polarisation ^11,12. Cependant, dès que l'irradiation par micro – ondes est arrêté et / ou du ^{13C-molécule} est transféré à l'état liquide, la polarisation se dégrade avec le temps de relaxation longitudinale _(T1) du noyau ¹³ C , qui a été polarisée. Ainsi, leinvention des techniques de dissolution rapide ou toute technique ultérieure de raccourcir le temps avant la mesure expérimentale (c. -à- injection) est crucial pour les applications biologiques ^13.

Il existe trois grandes exigences que la molécule candidate doit remplir pour succès ¹³ études CMRSI. D' abord, le noyau ¹³ C d'intérêt doit avoir une longueur suffisante T ₁ (> 10 s). Le choix du ¹³ C-étiquette est cruciale. Les meilleurs noyaux candidats sont des carbones sans contact direct avec ¹ H noyaux via une liaison. Il doit également être métabolisé rapidement dans 2 – 3 T ₁ fois, résultant en un produit métabolique aval avec une différence significative déplacement chimique de la substance d' origine. Le mélange de l' échantillon doit également former un verre amorphe lorsqu'il est dans un état solide , de telle sorte que la distribution spatiale diminue la distance entre les électrons et ¹³ C, ce qui permet la transfer de polarisation. Si la molécule candidate ne forme pas de verre amorphe naturellement, il doit être très soluble dans un agent de vitrification, tel que le glycerol ou le ¹⁴ diméthylsulfoxyde. Ces exigences se traduisent par un nombre relativement faible de molécules candidates. Cependant, même après la découverte réussie d'une molécule appropriée, l' élaboration d' un protocole de travail pour hyperpolarisation peut être techniquement difficile ^9,14,15.

Au cours des dernières années, plusieurs substrats ont été correctement polarisé, tel que le [1- ^13C] pyruvate ^{12,16 – 36} [2- ¹³ C] pyruvate ³⁷ [1- ^13C] pyruvate d' éthyle ³⁸ [1- ¹³ C ] lactate ^39, [1- ¹³ C] fumarate ^{40-43, 13} C-bicarbonate ^36,44,45, [1- ¹³ C] acétate de sodium ^{43,46 – 49, 13} C-urée ^6,36,50,51 [5- ¹³ C] glutamine ^15,52,53, [1- ¹³ C] glutamate ^53,54, [1- ¹³ C] 2-oxoglutarate ^55, [1- ¹³ C] alanine, et d' autres ^14,56. Un substrat particulièrement intéressant et couramment utilisé pour hyperpolarisation est [1- ¹³ C] pyruvate. Il est largement utilisé dans les études précliniques pour enquêter sur l'énergie du métabolisme cellulaire dans diverses maladies ^14,17,22. [1- ¹³ C] pyruvate répond à toutes les exigences pour hyperpolarisation succès, y compris un transport relativement longue T ₁ et rapide à travers la membrane cellulaire avant étant ensuite métabolisé. Les études précliniques avec [1- ¹³ C] pyruvate sont actuellement en cours de traduction dans la clinique ^57.

Métabolisme de pyruvate

Il est bien connu qu'il existe un lien direct entre des mutations dans l'ADN d'une des cellules cancéreuses et des changements dans les voies métaboliques. Déjà dans les années 1920, Otto Warburg découerts qu'il y a une augmentation du métabolisme du glucose et de production de lactate dans les tumeurs par rapport aux tissus sains ^58-60. Par la suite, plusieurs alternances dans d'autres voies métaboliques, telles que la voie des pentoses-phosphates, le cycle de l'acide tricarboxylique, la phosphorylation oxydative, et la synthèse des nucléotides et des lipides, ont été décrits.

Le pyruvate est le produit final de la glycolyse. Dans la tumeur, il subit une glycolyse anaérobie catalysée par la LDH ⁶¹ et réagit avec la forme réduite de la coenzyme nicotinamide adénine dinucléotide (NADH), ce qui entraîne le lactate et la forme oxydée de la co – enzyme (NAD ^+). En variante, le pyruvate subit une réaction de transamination avec le glutamate pour former l'alanine, catalysée par l'alanine transaminase (ALT). Les deux réactions sont facilement réversibles. Pyruvate subit également une décarboxylation catalysée par la pyruvate déshydrogénase (PDH) en dioxyde de carbone et de l'acétyl-CoA réductase, representing une réaction irréversible à cette étape. Alternances de ces vitesses de réaction peuvent être liés au métabolisme des tumeurs ^{17,21,22,25,62.} Les voies métaboliques sont résumés dans la figure 2.

Figure 2: Schéma de la principale réaction métabolique de pyruvate. Pyruvate / conversion du lactate est catalysée par la LDH et la conversion pyruvate / alanine est catalysée par ALT. Pyruvate est irréversiblement converti en acétyl-CoA et du CO ₂ par PDH, et le CO ₂ est dans un équilibre dépendant du pH avec du bicarbonate ^80. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

La détection de hyperpolarisé [1- ^13C] pyruvate et de ses métabolites ait déjà été démontrée chez le rat , il aart ^{37,63 – 65,} le foie ^66, les muscles et les reins ^62,67. Une étude a démontré des différences significatives dans le taux de lactate à alanine entre le foie de rat normal et à jeun ⁶⁶ et fait preuve d' une [1- ^13C] Le niveau très élevé et le lactate hyperpolarisé dans le cancer du foie , ^68,69. Il existe des preuves que le grade de la tumeur peut être identifié dans un adénocarcinome transgénique de la prostate de la souris (TRAMP) en utilisant hyperpolarisé [1- ¹³ C] pyruvate ^22, avec les niveaux de lactate hyperpolarisés montrant une forte corrélation avec le grade histologique des tumeurs excisées. Alanine à partir du pyruvate catalysée par ALT a également été suggérée comme un marqueur utile chez le rat ²³ carcinome hépatocellulaire.

Mesurer le flux métabolique pyruvate-lactate a été utilisé pour surveiller l' ischémie ^63,65,70 , et en réponse à un traitement avec des médicaments de chimiothérapie cytotoxique ^17,40, ciblés <sup> 24,25,41, ²⁶ ou d'une radiothérapie dans des modèles animaux. Il a également été utilisé pour la détection de la phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) de réponse LY294002 dans des modèles murins glioblastomes et un cancer du sein ^25. Les changements dans le métabolisme du pyruvate dans le cerveau des tumeurs ²⁶ et de la prostate ^24,71 ont également été observées après le traitement.

Carcinome de la prostate

Le carcinome de la prostate est le cancer prédominant chez les hommes âgés et le deuxième cancer le plus liés à la mort en hommes dans le monde ^72. À ce jour, aucune méthode fiable, non-invasives sont disponibles pour un diagnostic précoce et la caractérisation du cancer de la prostate ^73,74, en insistant sur le besoin urgent de techniques d'imagerie métabolique nouvelles pour permettre la détection rigoureuse et mise en scène de patients. Le carcinome de la prostate a été utilisé comme modèle pour mettre en évidence les possibilités de dissolution DNP combinée avec ¹³ CMRSI chez un patients ^57. Ce travail a été poursuivi dans un premier essai clinique utilisant [1- ¹³ C] pyruvate et ¹³ CMRSI pour l'imagerie du cancer de la prostate, et il a tout récemment a été achevée (NCT01229618).

La motivation derrière ce travail était d'illustrer plus en détail et pour un plus large public à l'application de la méthode CMRSI ¹³ dans un cadre préclinique avec des cellules. Mesurer le métabolisme de la LDH-catalysée de [1- ¹³ C] pyruvate à [1- ¹³ C] lactate in vitro dans la lignée de cellules de carcinome PC3 de la prostate, nous démontrons l'application éventuelle de dissolution DNP dans les études in vitro et d' aborder les étapes cruciales et défis au cours des expériences.

Protocol

1. Echantillon Stock Solution Préparation Ajouter gadotérate meglumine (GadM, 0,5 mol / L) et concentrée [1- 13 C] de l' acide pyruvique pour obtenir une concentration finale de 1 mmol / L GadM. Ajouter de tris radical trityle (8-carboxy-2,2,6,6-tétra- (hydroxyéthyl) -benzo- [1,2-4,5] -bis- (1,3) -dithiole-4-yl) – sel de sodium de méthyle (OX063) à ce mélange pour obtenir une concentration finale de 15 mmol / L. Vortex jusqu'à dissolution complète. NOTE: Cette préparation …

Representative Results

Les résultats du "coup de balai à micro – ondes" sont illustrés sur la figure 3. Elle montre que la fréquence des micro – ondes optimale pour la [1- 13C] pyruvate échantillon est à 94,156 GHz pour le 3,35-T hyperpolariseur locale. Toutes les expériences de l'hyperpolarisation suivante (n = 14) ont été effectuées en utilisant cette fréquence de micro-ondes d'une puissance de 100 mW. L'irradiation par micro-ondes a été appliqué pendant 60 à 80 min, ce qui co…

Discussion

¹³ CMRSI avec des sondes hyperpolarisé est un procédé prometteur pour surveiller en temps réel le métabolisme in vitro et in vivo. Un aspect très important lors de l' utilisation de ce processus expérimental est la normalisation appropriée, en particulier en ce qui concerne les expériences in vitro. Tout d'abord, la préparation de l'échantillon doit être effectué correctement et uniformément pour obtenir la même concentration en matériau hyperpol…

Materials

HyperSense DNP Polariser	Oxford Instruments		3.35 T preclinical DNP hyperpolarizer
GE/Agilent MR901	GE Healthcare/Agilent Technologies		7 T preclinical MRI scanner, with small bore designed for experiments onrodent
Spinsolve Carbon	Magritek		1 T NMR spectrometer with permanent magnet
Deuterium Oxide	Sigma Aldrich	7789-20-0
Sodium phosphate dibasic	Sigma Aldrich	7558-79-4
Sodium phosphate monbasic	Sigma Aldrich	7558-80-7
Sodium hydroxide	Sigma Aldrich	1310-73-2
Disodium edetate	Sigma Aldrich	6381-92-6
Pyruvic acid – 13C1	Cambridge Isotopes Laboratories	CLM-8077-1
Dotarem (0.5 mmol/L)	Guerbet		gadoterate meglumine
tris (8-carboxy-2,2,6,6-tetra-(hydroxyethyl)-benzo-[1,2–4,5]-bis-(1,3)-dithiole-4-yl)-methyl sodium salt (OX063)	GE Healthcare		trityl radical used as a sourse of free electron
PC3 cell line	ATCC	CRL1435
F-12K medium	ATCC	30-2004
Fetal Bovine Serum	ATCC	SCRR-30-2020
Trypsine-EDTA Solution, 1X	ATCC	30-2101
Sample plastic cup	Oxford Instruments
Trypan blue	Bio-Rad	145-0013-MSDS