hiperpolarizado¹³ C metabólico espectroscopía de resonancia magnética e Imagen

Summary

Dynamic nuclear polarization with subsequent sample dissolution has enabled real-time studies of metabolism in biological systems. Hyperpolarized [1-¹³C]pyruvate was used to study lactate dehydrogenase activity in a prostate carcinoma cell line in vitro.

Abstract

En las últimas décadas, los nuevos métodos para la estadificación del tumor, nueva puesta en escena, la supervisión la respuesta al tratamiento, y la detección de la recurrencia de una variedad de cánceres han surgido en relación con la tomografía por emisión de positrones estado de la técnica con ¹⁸ F-FDG ^([18F ] FDG PET). ¹³ C resonancia magnética espectroscópica ⁽¹³ CMRSI) es un método de formación de imágenes mínimamente invasiva que permite la supervisión del metabolismo in vivo y en tiempo real. Al igual que con cualquier otro método basado en ¹³ C de resonancia magnética nuclear (RMN), se enfrenta al reto de baja polarización térmica y una posterior baja relación señal-ruido debido a la relativamente baja relación giromagnética de ¹³ C y su baja abundancia natural en muestras biológicas. Al superar estas limitaciones, la polarización nuclear dinámica (DNP) con la posterior disolución de la muestra ha permitido recientemente utilizada sistemas de imagen de resonancia magnética (MRI) de RMN y para medir, El estudio y la imagen vías metabólicas clave en diversos sistemas biológicos. Una molécula particularmente interesante y prometedora utilizado en ¹³ CMRSI es [1- ¹³ C] piruvato, que, en los últimos diez años, ha sido ampliamente utilizado para in vitro, preclínica, y, más recientemente, los estudios clínicos para investigar el metabolismo de la energía celular en el cáncer y otras enfermedades. En este artículo, se describe la técnica de disolución DNP usando un preclínica hiperpolarizadora DNP 3,35 T y demostrar su uso en estudios in vitro. Un protocolo similar para la hiperpolarización se puede aplicar en su mayor parte en estudios in vivo también. Para ello, se utilizó lactato deshidrogenasa (LDH) y la reacción catalizada metabólica de [1- ¹³ C] piruvato a lactato [1- ¹³ C] en una línea celular de carcinoma de próstata, PC3, in vitro utilizando ¹³ CMRSI.

Introduction

Actualmente, el método clínico más ampliamente utilizado para la estadificación del tumor, nueva puesta en escena, la supervisión la respuesta al tratamiento, y la detección de la recurrencia de una amplia variedad de cánceres es ^[18F] FDG PET. ¹ Sin embargo, recientemente, han surgido varios nuevos enfoques y alternativas. Uno de esos métodos es ¹³ CMRSI. Esta técnica consiste en la introducción de la molécula de ^C-13 en una muestra biológica, seguido de MRI mínimamente invasivo para evaluar el metabolismo in vitro o in vivo en tiempo real. Sin embargo, el mayor reto de ¹³ CMRSI, en comparación con los otros métodos tales como ^[18 F] FDG PET o tomografía computarizada, es su baja relación señal-ruido.

La señal de RMN es directamente proporcional al nivel de polarización, una proporción de la diferencia de población espín ½ núcleos en dos estados de energía de la población total (Figura 1A). La polarización es un producto de THrelación e giromagnética (γ) de los núcleos y la intensidad del campo magnético aplicado encima de la temperatura. Una polarización típico de ¹ H núcleos es del orden de 0,001% a 0,005% a 3 T, lo que da una relativamente pobre relación señal-ruido. RM de hoy el estado de la técnica ha sido un método de imagen éxito sólo debido a la gran abundancia de ^1H en muestras biológicas y la alta relación giromagnética de ^1H _(1H gamma = 42,576 MHz / T). Sin embargo, la observación de otros núcleos, tales como el carbono, es más exigente. El único isótopo de carbono estable magnéticamente activa, ^13C, representa sólo el 1,1% de todos los átomos de carbono. Además, la relación giromagnética de ¹³ C (γ _13C = 10,705 MHz / T) es cuatro veces menor que la de ¹ H, dando lugar a una eficiencia de detección inferior. En resumen, la baja abundancia ^{de 13C} y _13C bajo γ causan mediciones térmicas ¹³ C para alcanzar 0,0176% de la sensibilidad de un ¹Medición H-NMR in vivo.

La polarización nuclear dinámica

Un método para superar la relativamente pobre sensibilidad de ¹³ mediciones C es DNP. Fue descrito originalmente para metales en 1953 por Albert W. Overhauser. En su artículo, declaró: "Se demuestra que si se satura la resonancia de espín electrónico de los electrones de conducción, los núcleos se polarizan en el mismo grado que serían si su relación giromagnética eran la del espín del electrón." ² más adelante ese año, Carver y Slichter confirmó experimentalmente ^la hipótesis ³ de Overhauser. En 1958, Abragam y Procter describen este efecto para los electrones en los líquidos y la llamó el "efecto sólido." A temperaturas inferiores a 4 K, la polarización de espín electrónico alcanza casi el 100% y es más de tres órdenes de magnitud más alta que la polarización de espín nuclear (Figura 1B) ^4. Tsu se produce porque la relación giromagnética del electrón (γ _e = 28024.944 MHz / T) es tres órdenes de magnitud más alta que las proporciones giromagnéticas nucleares. Las interacciones débiles entre los electrones y los núcleos, tales como el efecto Overhauser, el efecto sólido, el efecto cruz, y el efecto de mezclado térmico, permiten la transferencia de polarización a partir de electrones hace girar a espines nucleares usando irradiación de microondas con una frecuencia cercana a la de electrones correspondiente resonancia paramagnética (EPR) ^5,6 frecuencia. DNP teoría ha sido desarrollada para involucrar a más electrones y la mezcla térmica. Sin embargo, hasta la fecha, no unificada descripción teórica cuantitativa de DNP ha sido publicada ^7,8.

Figura 1: comprensión dinámica de polarización nuclear y hiperpolarización. A) Una comparación esquemática de la población de centrifugadoen el estado de equilibrio térmico y la polarización del estado hiperpolarizado. B) La polarización depende de la temperatura. La polarización de un electrón (e ^-) alcanza 100% por debajo de 1,4 K. El DNP permite la transferencia de la polarización de la e- a los ¹³ núcleos de C, lo que aumenta su polarización de hasta 10 ⁵ -fold. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Para introducir DNP en los estudios de sistemas biológicos usando ^13C, la posterior disolución rápida de la muestra tuvo que ser desarrollado. 50 años después de la hipótesis de Overhauser, Jan H. Ardenkjaer-Larsen et al. resuelto el problema técnicamente difícil de llevar la muestra congelada hiperpolarizado en el estado líquido con una pérdida mínima de hiperpolarización ^6. Disolución DNP abre un nuevo campo de investigación llamado ¹³ CMRSI, proporcionando un nuevo método para investigar y caracterizar diversos estados de enfermedad ^9,10. Como excipientes estables de un electrón no apareado, un tris radical tritilo (8-carboxi-2,2,6,6-tetra- (hidroxietil) -benzo- [1,2-4,5] bis- (1,3) -dithiole-4-il) metil sal de sodio (OX063) o (2,2,6,6-tetrametil-piperidin-1-il) oxilo (TEMPO) se utiliza por lo general. Estos se mezclan con la ¹³ molécula de C marcado deseado y se expusieron a irradiación de microondas con una frecuencia cercana a la frecuencia EPR correspondiente. Usando esta técnica, la polarización de los núcleos ¹³ C se puede aumentar hasta 37% ^11. Esto se traduce en una mejora de la polarización -fold 10 ⁵ en comparación con la polarización de equilibrio térmico ^11,12. Sin embargo, tan pronto como la irradiación con microondas se detiene y / o el C-molécula ¹³ se transfiere al estado líquido, la polarización decae con el tiempo de relajación longitudinal (T ₁₎ del núcleo ¹³ C que se polariza. Por lo tanto, lainvención de técnicas de disolución rápida o cualquier técnica posterior acortar el tiempo antes de la medición experimental (es decir, inyección) es crucial para aplicaciones biológicas ^13.

Hay tres principales requisitos que la molécula candidata necesita para cumplir con éxito de ¹³ estudios CMRSI. En primer lugar, el núcleo ¹³ C de interés tiene que tener un tiempo suficientemente largo T ₁ (> 10 s). La elección de la etiqueta ^C-13 es crucial. Los mejores candidatos son núcleos de átomos de carbono que no tienen contacto directo con ^1-H núcleos través de un enlace. También necesita ser metabolizado rápidamente dentro de 2 – 3 veces T _1, dando como resultado un producto metabólico corriente abajo con un desplazamiento químico significativamente diferente de la sustancia original. La mezcla de la muestra también debe formar un vidrio amorfo cuando está en un estado sólido de modo que la distribución espacial disminuye la distancia entre el electrón y ¹³ C, permitiendo que el transfer de polarización. Si la molécula candidata no forma vidrio amorfo de forma natural, que tiene que ser altamente soluble en un agente de acristalado, tal como glicerol o sulfóxido de dimetilo ^14. Estos requisitos dan como resultado un número relativamente pequeño de moléculas candidatas. Sin embargo, incluso después del descubrimiento con éxito de una molécula adecuada, el desarrollo de un protocolo de trabajo para la hiperpolarización puede ser técnicamente difícil ^9,14,15.

En los últimos años, varios sustratos han sido exitosamente polarizado, tales como [1- ¹³ C] piruvato ^{12,16 – 36,} [2- ¹³ C] piruvato ^37, [1- ¹³ C] piruvato de etilo ^38, [1- ¹³ C ] lactato ^39, [1- ¹³ C] fumarato ^{40 – 43, 13,} C-bicarbonato de ^36,44,45, [1- ¹³ C] acetato de sodio ^{43,46 – 49, 13} C-urea ^6,36,50,51 , [5- ¹³ C] glutamine ^15,52,53, [1- ¹³ C] glutamato ^53,54, [1- ¹³ C] 2-oxoglutarato ^55, [1- ¹³ C] alanina, y otros ^14,56. Un sustrato particularmente interesante y de uso general para la hiperpolarización es [1- ¹³ C] piruvato. Es ampliamente utilizado en estudios preclínicos para investigar la energía metabolismo celular en diversas enfermedades ^14,17,22. [1- ¹³ C] piruvato cumple con todos los requisitos para la hiperpolarización éxito, incluyendo un transporte relativamente largo T ₁ y rápida a través de la membrana celular antes de ser metabolizados posteriormente. Los estudios preclínicos con piruvato [1- ¹³ C] Actualmente se están traduciendo en la clínica ^57.

El metabolismo de piruvato

Es bien sabido que hay una relación directa entre las mutaciones en el ADN y los cambios en sus vías metabólicas de un cáncer de células. Ya en la década de 1920, Otto Warburg descuEred que hay un aumento del metabolismo de la glucosa y la producción de lactato en los tumores en comparación con tejido sano ^58-60. Posteriormente, diversas alteraciones en otras vías metabólicas, tales como la vía de las pentosas fosfato, el ciclo del ácido tricarboxílico, la fosforilación oxidativa, y la síntesis de nucleótidos y lípidos, se han descrito.

El piruvato es el producto final de la glicólisis. En el tumor, se somete a la glucólisis anaeróbica catalizada por la LDH ⁶¹ y reacciona con la forma reducida del dinucleótido de adenina nicotinamida coenzima (NADH), dando como resultado lactato y la forma oxidada de la coenzima (NAD ^+). Alternativamente, el piruvato se somete a una reacción de transaminación con glutamato para formar alanina, catalizada por la alanina transaminasa (ALT). Ambas reacciones son fácilmente reversible. El piruvato también se somete a descarboxilación catalizada por la piruvato deshidrogenasa (PDH) en dióxido de carbono y acetil-CoA, rREPRESENTAN una reacción irreversible en este paso. Alternancias en estas velocidades de reacción pueden estar relacionados con el metabolismo del tumor ^{17,21,22,25,62.} Las vías metabólicas se resumen en la Figura 2.

Figura 2: Esquema de la importante reacción metabólica del piruvato. Piruvato de conversión / lactato es catalizada por la LDH, y la conversión de piruvato / alanina es catalizada por la ALT. El piruvato se convierte irreversiblemente a acetil-CoA y CO ₂ por PDH, y CO ₂ se encuentra en un equilibrio dependiente del pH con bicarbonato de ^80. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La detección de hiperpolarizado [1- ¹³ C] piruvato y sus metabolitos se ha demostrado previamente en la rata élarte ^{37,63 – 65, 66} de hígado, músculo y riñón ^62,67. Un estudio demostró diferencias significativas en la proporción de lactato-alanina entre el hígado de rata normal y ayunaron ⁶⁶ y demostró un nivel muy elevado de lactato hiperpolarizado y [1- ¹³ C] en el cáncer de hígado ^68,69. Hay pruebas de que el grado del tumor se puede identificar en un adenocarcinoma transgénico de próstata de ratón (TRAMP) utilizando hiperpolarizado piruvato [1- ¹³ C] ^22, con los niveles de lactato hiperpolarizados que muestran una alta correlación con el grado histológico de los tumores extirpados. La alanina catalizada a partir de piruvato por ALT también se ha sugerido como un marcador útil en la rata carcinoma hepatocelular ^23.

La medición de la flujo metabólico piruvato-lactato se ha utilizado para el control de isquemia ^63,65,70 y como respuesta al tratamiento con fármacos citotóxicos quimioterapia ^17,40, dirigidos <sup> 24,25,41, ²⁶ o radioterapia en modelos animales. También se ha utilizado para la detección del inhibidor LY294002 respuesta fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K) en el glioblastoma y el cáncer de mama modelos de ratón ^25. Los cambios en el metabolismo del piruvato en tumores cerebrales ²⁶ y cáncer de próstata ^24,71 también se han observado después del tratamiento.

Carcinoma de próstata

El carcinoma de próstata es el cáncer predominante en hombres de edad avanzada y el segundo cáncer más importantes relacionados con la muerte en los hombres en todo el mundo ^72. Hasta la fecha, no existen métodos fiables y no invasivas están disponibles para el diagnóstico precoz y la caracterización de cáncer de próstata ^73,74, haciendo hincapié en la necesidad urgente de nuevas técnicas de imagen metabólica para permitir la detección rigurosa y la estadificación de los pacientes. Carcinoma de próstata se utilizó como modelo para demostrar las posibilidades de DNP disolución combinados con ¹³ CMRSI en pacientes ^57. Este trabajo fue continuado en un primer ensayo clínico que emplea [1- ¹³ C] piruvato y ¹³ CMRSI para la obtención de imágenes de cáncer de próstata, y ha recientemente se ha completado (NCT01229618).

La motivación detrás de este trabajo era ilustrar con más detalle y para un público más amplio de la aplicación del método CMRSI ¹³ en un entorno preclínico con las células. La medición del metabolismo de la LDH-catalizada de [1- ¹³ C] piruvato a [1- ¹³ C] lactato in vitro en la línea celular de carcinoma de próstata PC3, se demuestra la posible aplicación de DNP disolución en estudios in vitro y la dirección de los pasos cruciales y desafíos durante los experimentos.

Protocol

1. Ejemplo de Preparación de la Solución Añadir gadoterato meglumina (GADM, 0.5 mol / L) a ácido concentrado [1- 13 C] pirúvico para dar una concentración final de 1-mmol / L GADM. Añadir tritilo tris radical (8-carboxi-2,2,6,6-tetra- (hidroxietil) -benzo- [1,2-4,5] bis- (1,3) -dithiole-4-il) – sal de sodio y metilo (OX063) a esta mezcla para dar una concentración final de 15 mmol / L. Vortex hasta disolución completa. NOTA: Esta preparación solución madre está diseñado para su …

Representative Results

Los resultados del "barrido de microondas" se ilustran en la Figura 3. Se muestra que la frecuencia de microondas óptima para el [1- 13 C] muestra piruvato es en 94,156 GHz para el local de hiperpolarizador 3,35-T. Todos siguiente experimento hiperpolarización (n = 14) se realizaron con esta frecuencia de microondas con una potencia de 100 mW. La irradiación de microondas se aplicó durante 60 a 80 min, lo que lleva a una hiperpolarización de estado sólido mayor que 90%. Los re…

Discussion

¹³ CMRSI con sondas hiperpolarizados es un método prometedor para controlar el metabolismo en tiempo real in vitro e in vivo. Un aspecto muy importante cuando se emplea este proceso experimental es la estandarización adecuada, especialmente en relación con los experimentos in vitro. En primer lugar, la preparación de la muestra que hay que hacer correctamente y consistentemente para lograr la misma concentración de material hiperpolarizado en cada experimento. Esto req…

Materials

HyperSense DNP Polariser	Oxford Instruments		3.35 T preclinical DNP hyperpolarizer
GE/Agilent MR901	GE Healthcare/Agilent Technologies		7 T preclinical MRI scanner, with small bore designed for experiments onrodent
Spinsolve Carbon	Magritek		1 T NMR spectrometer with permanent magnet
Deuterium Oxide	Sigma Aldrich	7789-20-0
Sodium phosphate dibasic	Sigma Aldrich	7558-79-4
Sodium phosphate monbasic	Sigma Aldrich	7558-80-7
Sodium hydroxide	Sigma Aldrich	1310-73-2
Disodium edetate	Sigma Aldrich	6381-92-6
Pyruvic acid – 13C1	Cambridge Isotopes Laboratories	CLM-8077-1
Dotarem (0.5 mmol/L)	Guerbet		gadoterate meglumine
tris (8-carboxy-2,2,6,6-tetra-(hydroxyethyl)-benzo-[1,2–4,5]-bis-(1,3)-dithiole-4-yl)-methyl sodium salt (OX063)	GE Healthcare		trityl radical used as a sourse of free electron
PC3 cell line	ATCC	CRL1435
F-12K medium	ATCC	30-2004
Fetal Bovine Serum	ATCC	SCRR-30-2020
Trypsine-EDTA Solution, 1X	ATCC	30-2101
Sample plastic cup	Oxford Instruments
Trypan blue	Bio-Rad	145-0013-MSDS