O mouse rim isolado perfundido (MIPK) é uma técnica para manter um rim do rato em condições ex vivo perfundidos e funcionais durante 1 h. Os tampões e técnica cirúrgica encontram-se descritos em pormenor.
O mouse rim isolado perfundido (MIPK) é uma técnica para manter um rim do rato em condições ex vivo perfundidos e funcionais durante 1 h. Este é um pré-requisito para o estudo da fisiologia do órgão isolado e para muitas aplicações inovadoras que possam ser possíveis no futuro, incluindo decellularization perfusão de bioengenharia nos rins ou a administração de anti-rejeição ou drogas edição do genoma em altas doses para preparar o rim para transplante. Durante o tempo da perfusão, o rim pode ser manipulada, a função renal pode ser avaliada, e vários produtos farmacêuticos administrados. Após o procedimento, o rim transplantado ou pode ser processado para a biologia molecular, bioquímica, ou microscopia.
Este artigo descreve o perfusado e da técnica cirúrgica necessária para a perfusão ex-vivo de rins de rato. Os detalhes do aparelho de perfusão são dados e os dados são apresentados mostrando o vESPONSABILIDADE da preparação do rim: fluxo sangüíneo renal, resistência vascular, e urina dados como funcionais, micrografias eletrônicas de transmissão de diferentes segmentos dos néfrons como leituras morfológicas e Western blot de proteínas de transporte de diferentes segmentos dos néfrons como leitura molecular.
A perfusão isolada de órgãos tem sido objecto de um esforço contínuo entre os fisiologistas por muitas décadas 1. A técnica permite que a função do órgão, sem influências sistêmicas, tais como pressão arterial, hormônios ou nervos, a ser estudado. Carl Eduard Loebell é considerado para ser o primeiro a ter descrito a perfusão bem sucedida de um rim isolado, em 1849 2. Desde então, o aparelho de perfusão foi submetido refinamento significativa. Frey e Gruber introduzido um pulmão artificial para bombas de oxigenação e pulsátil para perfusão contínua 2. Enquanto os primeiros pesquisadores estudaram principalmente os rins de mamíferos de grande porte, ou seja, porcos e cães 2 3 -o primeiro relatório do uso de rins de ratos, por Weiss et al. , Foi um marco no estudo da perfusão-mamífero-órgão pequeno 4. Schurek et ai. relataram a necessidade de adição de eritrócitos de mamífero para o perfusato se tubular renal suficienteoxigenação deveria ser alcançado 5. Crítico para experiências a longo prazo foi a introdução de diálise contínua do tampão pelo mesmo grupo de pesquisa 6. Em 2003, Schweda et al. foram os primeiros a relatar um rim do rato funcional isolado perfundido (MIPK) 7, posteriormente refinado por Rahgozar et al. 18 e Lindell et ai. 14.
Embora tecnicamente mais exigente do que o de rato perfundido isolado de rim, o uso do MIPK carrega a vantagem de permitir o uso de uma grande variedade de ratinhos geneticamente alterados. Este artigo apresenta os dados sobre o método dos autores para perfusão isolados de rato rins durante 1 h. O método permite a avaliação contínua da taxa renal fluxo, resistência vascular, liberação de hormônio, gasometria, análise de urina, bem como a aplicação de medicamentos. Seguindo o procedimento, rins podem ser processadas para análise molecular e bioquímica, ser fixo por microscopia, outransplantado para um rato receptor (Figura 1).
Figura 1: Visão geral do Possível entrada / saída para o rim isolado perfundido. BGA: Hemogasometria. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Esta técnica provavelmente vai receber uma atenção crescente nos próximos anos, como muitas aplicações inovadoras estão sendo discutidas com o alvorecer da perfusão renal normotérmica prolongado antes do transplante (com ou sem a aplicação de anti-rejeição ou drogas edição do genoma) 8, 9, 10 , 11, a bioengenharia dos rins inteiros de andaimes descelularizados 12, bem como a aplicação de doses elevadas de corantes fluorescentes para a imagem latente multiphoton 13 </sup>. Também é um modelo ideal com o qual se estudar o papel de genes específicos durante a lesão renal aguda 14.
Um protocolo de passo-a-passo é dado para permitir que outros laboratórios para realizar isolado rato perfusão renal com sucesso. Em primeiro lugar, a composição e preparação do buffer é especificado. Em seguida, a cirurgia é descrito em pormenor e os passos críticos são mostrados. Em terceiro lugar, os dados são apresentados que são representativos de uma preparação bem sucedida: o fluxo sanguíneo renal, resistência vascular, taxa de filtração glomerular, e eletrólitos fraccionada medições funcionais de viabilidade e eletrônica de transmissão micrografias da morfologia dos diferentes segmentos dos néfrons de Rins todos excreção- fixado após 1 hora de perfusão.
O mouse rim isolado perfundido é uma ferramenta para o estudo da função renal em um ambiente controlado ex vivo, durante 1 hora, fazendo a ponte entre experiências in vivo em animais intactos, o que pode ser falho pelo impacto de vários fatores sistêmicos e experimentos in vitro em segmentos dos néfrons isolados ou células cultivadas, o que necessariamente negligenciam o impacto da estrutura de órgãos intactos na função. Há, ao conhecimento dos autores, nenhuma técnica alternativ…
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank Hans-Joachim Schurek for invaluable scientific advice. The authors would like to thank Monique Carrel and Michèle Heidemeyer for excellent technical assistance, David Penton Ribas and Nourdine Faresse for a critical reading of the manuscript and Carsten Wagner and Jürg Biber for the NaPi-2a antibody. This work was supported by the Swiss National Centre for Competence in Research “Kidney.CH” and by a project grant (310030_143929/1) from the Swiss National Science Foundation.
Perfusion Circuit: | |||
Moist chamber 834/8 | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-2901 | |
Cannular with basket and side port | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-2947 | |
Thermostat TC120-ST5 | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-4544 | |
ISM 827/230V Roller Pump Reglo Analogue | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-0114 | |
Reservoir jacketed for buffer solution 1L | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-3438 | |
Reservoir jacketed for buffer solution 0.5L | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-3436 | |
Pressure Transducer APT300 | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-3862 | |
TAM-D Plugsys Transducer | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-1793 | |
SCP Plugsys servo controller | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-2806 | |
Windkessel | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-3717 | |
HSE-USB data acquisition | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-3330 | |
Low-Flux Dialysator Diacap Polysulfone | B.Braun | 7203525 | |
PE-Tubing for aorta cannulation 1.19mm I.D. x 1.70mm O.D. | Scientific Commodities Inc. | BB31695-PE/8 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Buffer reagents: | |||
Aminoplasmal 10% | B.Braun | 134518064 | |
Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256-25G | |
L-Glutamic acid monosodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G1626-100G | |
L-(-)-Malic acid sodium salt | Sigma-Aldrich | M1125-25G | |
Sodium-L-Lactate | Sigma-Aldrich | L7022-10G | |
alpha-Ketoglutaric acid sodium salt | Sigma-Aldrich | K1875-25G | |
NaCl | Sigma-Aldrich | 31434-1KG-R | |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761-5KG | |
KCl | Sigma-Aldrich | 60130-1KG | |
Urea | Sigma-Aldrich | U5378-500G | |
Creatinine | Sigma-Aldrich | C4255-10G | |
Ampicillin | Roche | 10835242001 | |
MgCl2 * 6H2O | Sigma-Aldrich | M2393-500G | |
D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
CaCl2 * 6H2O | Riedel-de-Haën | 12074 | |
NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638-500G | |
Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S0876-500G | |
Antidiuretic Hormone dDAVP | Sigma-Aldrich | V2013-1MG | |
FITC-Inulin | Sigma-Aldrich | ||
Filter used for erythrocyte filtration | Macherey-Nagel | MN 615 | |
BGA Analysis: | |||
ABL 80 flex | Radiometer Medical ApS | ||
Electron Microscope: | |||
Philips CM100 TEM | FEI |