الماوس معزولة الكلى perfused (MIPK) هي تقنية للحفاظ على الكلى الماوس تحت المجراة سابقا الظروف perfused وظيفية لمدة 1 ساعة. ويرد في مخازن وتقنية جراحية في التفاصيل.
الماوس معزولة الكلى perfused (MIPK) هي تقنية للحفاظ على الكلى الماوس تحت المجراة سابقا الظروف perfused وظيفية لمدة 1 ساعة. وهذا شرط أساسي لدراسة علم وظائف الأعضاء من الجهاز معزولة وللعديد من التطبيقات المبتكرة التي قد يكون من الممكن في المستقبل، بما في ذلك decellularization نضح عن الهندسة الحيوية الكلى أو إدارة مكافحة الرفض أو المخدرات تحرير الجينوم في جرعات عالية لرئيس الكلية للزرع. خلال ذلك الوقت من نضح، والكلى يمكن التلاعب بها، ويمكن تقييم وظائف الكلى، ومختلف المواد الصيدلانية تدار. بعد العملية، والكلى يمكن زرعها أو تجهز لعلم الأحياء الجزيئي، وتحليل الكيمياء الحيوية، أو المجهري.
وتصف هذه الورقة الإرواء والتقنية الجراحية اللازمة لنضح خارج الجسم الحي الكلى الماوس. وترد تفاصيل جهاز نضح وقدمت بيانات تظهر الخامسiability من إعداد والكلى: تدفق الدم الكلوي، ومقاومة الأوعية الدموية، والبول بيانات وظيفية، الميكروسكوب الإلكتروني النافذ من شرائح كليون المختلفة وقراءات المورفولوجية، والبقع الغربية من البروتينات نقل شرائح كليون المختلفة وقراءات الجزيئية.
وقد نضح معزولة من الأجهزة موضوع جهد مستمر بين فسيولوجي لعقود عديدة 1. هذه التقنية تتيح وظيفة الجهاز، دون التأثيرات الجهازية مثل ارتفاع ضغط الدم، والهرمونات، أو الأعصاب، لدراستها. يعتبر كارل إدوارد Loebell أن يكون أول من وصف نضح الناجح لالكلى معزولة، في عام 1849 2. ومنذ ذلك الحين، شهدت جهاز نضح صقل كبير. قدم فراي وغروبر رئة اصطناعية لالأوكسجين ونابض مضخات نضح المستمر 2. في حين الباحثين في وقت مبكر درس أساسا الكلى من الثدييات وهي كبيرة والخنازير والكلاب 2 3 -The التقرير الأول للاستخدام الكلى الفئران، التي فايس وآخرون. ، كان علامة فارقة في دراسة صغيرة الثدييات جهاز نضح (4). Schurek وآخرون. ذكرت ضرورة إضافة الكريات الحمراء الثدييات إلى الإرواء إذا أنبوبي كلوي كافيةكان الأوكسجين إلى أن يتحقق 5. حاسمة لتجارب طويلة الأمد كانت مقدمة من غسيل الكلى المستمر من المخزن المؤقت من قبل نفس المجموعة البحثية 6. في عام 2003، Schweda وآخرون. كانوا أول من الإبلاغ عن الكلى الماوس وظيفية معزولة perfused (MIPK) 7، والمكرر في وقت لاحق من قبل Rahgozar وآخرون. 18 ويندل وآخرون. 14.
بينما من الناحية الفنية أكثر تحديا من الفئران المعزولة الكلى perfused، واستخدام MIPK يحمل ميزة تمكن من استخدام مجموعة واسعة من الفئران المعدلة وراثيا. تعرض هذه الورقة على تفاصيل طريقة المؤلفين من أجل perfusing الكلى الماوس معزولة لمدة 1 ساعة. يسمح أسلوب التقييم المستمر لمعدل الكلوي تدفق، ومقاومة الأوعية الدموية، والإفراج عن هرمون، تحليل غازات الدم وتحليل البول، وتطبيق المخدرات. وبعد هذا الإجراء، يمكن معالجتها الكلى للتحليل الجزيئي والكيمياء الحيوية، وتكون ثابتة للفحص المجهري، أوزرعه في الماوس المتلقي (الشكل 1).
الشكل 1: نظرة عامة على احتمال الإدخال / الإخراج إلى الكلى Perfused المعزولة. بغا: تحليل الدم الغاز. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
هذه التقنية من المرجح أن تلقي اهتماما متزايدا في السنوات القادمة، كما يتم مناقشة العديد من التطبيقات المبتكرة مع فجر لفترات طويلة نضح الكلى سوي الحرارة قبل الزرع (مع أو من دون تطبيق المضادة للرفض أو عقاقير تحرير الجينوم) 8، 9، 10 ، 11، والهندسة الحيوية الكلى كلها من السقالات decellularized 12، وتطبيق جرعات عالية من الأصباغ الفلورية لmultiphoton التصوير 13 </sup>. بل هو أيضا نموذج مثالي مع الذي لدراسة دور الجينات المحددة خلال قصور كلوي حاد 14.
ويرد بروتوكول خطوة بخطوة للسماح غيرها من المختبرات لأداء معزولة الماوس نضح الكلى بنجاح. أولا، يتم تحديد تكوين وإعداد المخزن المؤقت. ثم، يتم وصف عملية جراحية في التفاصيل وتعرض الخطوات الحاسمة. ويرد الثالث، البيانات التي تمثل من الإعداد الناجح: تدفق الدم الكلوي، ومقاومة الأوعية الدموية، معدل الترشيح الكبيبي، والكهارل كسور إفراز للجميع القياسات وظيفية من الميكروسكوب الجدوى والإلكترون انتقال مورفولوجية قطاعات كليون مختلفة من الكلى perfused ثابت بعد 1 ساعة من نضح.
الماوس معزولة الكلى perfused هو أداة لدراسة وظائف الكلى في بيئة تسيطر عليها خارج الجسم لمدة 1 ساعة، سد الفجوة بين التجارب المجراة على الحيوانات سليمة، والتي قد تكون معيبة بسبب تأثير العوامل النظامية عديدة، وفي التجارب المختبرية في شرائح كليون معزولة …
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank Hans-Joachim Schurek for invaluable scientific advice. The authors would like to thank Monique Carrel and Michèle Heidemeyer for excellent technical assistance, David Penton Ribas and Nourdine Faresse for a critical reading of the manuscript and Carsten Wagner and Jürg Biber for the NaPi-2a antibody. This work was supported by the Swiss National Centre for Competence in Research “Kidney.CH” and by a project grant (310030_143929/1) from the Swiss National Science Foundation.
Perfusion Circuit: | |||
Moist chamber 834/8 | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-2901 | |
Cannular with basket and side port | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-2947 | |
Thermostat TC120-ST5 | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-4544 | |
ISM 827/230V Roller Pump Reglo Analogue | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-0114 | |
Reservoir jacketed for buffer solution 1L | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-3438 | |
Reservoir jacketed for buffer solution 0.5L | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-3436 | |
Pressure Transducer APT300 | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-3862 | |
TAM-D Plugsys Transducer | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-1793 | |
SCP Plugsys servo controller | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-2806 | |
Windkessel | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-3717 | |
HSE-USB data acquisition | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-3330 | |
Low-Flux Dialysator Diacap Polysulfone | B.Braun | 7203525 | |
PE-Tubing for aorta cannulation 1.19mm I.D. x 1.70mm O.D. | Scientific Commodities Inc. | BB31695-PE/8 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Buffer reagents: | |||
Aminoplasmal 10% | B.Braun | 134518064 | |
Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256-25G | |
L-Glutamic acid monosodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G1626-100G | |
L-(-)-Malic acid sodium salt | Sigma-Aldrich | M1125-25G | |
Sodium-L-Lactate | Sigma-Aldrich | L7022-10G | |
alpha-Ketoglutaric acid sodium salt | Sigma-Aldrich | K1875-25G | |
NaCl | Sigma-Aldrich | 31434-1KG-R | |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761-5KG | |
KCl | Sigma-Aldrich | 60130-1KG | |
Urea | Sigma-Aldrich | U5378-500G | |
Creatinine | Sigma-Aldrich | C4255-10G | |
Ampicillin | Roche | 10835242001 | |
MgCl2 * 6H2O | Sigma-Aldrich | M2393-500G | |
D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
CaCl2 * 6H2O | Riedel-de-Haën | 12074 | |
NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638-500G | |
Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S0876-500G | |
Antidiuretic Hormone dDAVP | Sigma-Aldrich | V2013-1MG | |
FITC-Inulin | Sigma-Aldrich | ||
Filter used for erythrocyte filtration | Macherey-Nagel | MN 615 | |
BGA Analysis: | |||
ABL 80 flex | Radiometer Medical ApS | ||
Electron Microscope: | |||
Philips CM100 TEM | FEI |