כלית perfused העכבר המבודדת (MIPK) היא טכניקה לשמירת כלית עכבר בתנאי vivo לשעבר perfused ופונקציונלי עבור שעה 1. החוצצים טכניקה כירורגית מתוארים בפירוט.
כלית perfused העכבר המבודדת (MIPK) היא טכניקה לשמירת כלית עכבר בתנאי vivo לשעבר perfused ופונקציונלי עבור שעה 1. זהו תנאי הכרחי ללימוד הפיזיולוגיה של האיבר מבודד עבור יישומים חדשניים רבים שעשויים להיות אפשרי בעתיד, כולל decellularization זלוף עבור Bioengineering כליות או הממשל של נוגדות דחייה או תרופות עריכת הגנום במינונים גבוהים פריים הכליה להשתלה. במהלך הזמן של זלוף, הכליה ניתן להשפיע, תפקוד כלייתי ניתן להעריך, ומגוון תרופות מנוהלות. לאחר שהסתיים ההליך, הכליה ניתן להשתיל או מעובדי ביולוגיה מולקולרית, לאנליזה ביוכימית, או במיקרוסקופ.
מאמר זה מתאר את perfusate ואת הטכניקה הניתוחית דרושה זלוף vivo לשעבר של כליות עכבר. פרטים של מנגנון זלוף ניתנים ונתונים מוצגים מראים את נiability של הכנת הכליות: זרימת דם כליות, התנגדות כלי דם, ונתונים שתנו כמו micrographs אלקטרונים פונקציונלי, שידור של מגזרים נפרון שונים כמו readouts מורפולוגיים, וכתמים מערביים של חלבוני תחבורה של מגזרים נפרון שונים כמו readout המולקולרית.
זלוף מבודד איברים כבר את הנושא של מאמץ מתמשך בין פיזיולוגים במשך עשורים רבים 1. הטכניקה מאפשרת את הפונקציה של האיברים, ללא השפעות מערכתיות כגון לחץ דם, הורמונים, או עצבים, כדי להיחקר. קרל אדוארד Loebell נחשב הראשון תאר את זלוף המוצלח של כליות מבודדות, בשנת 1849 2. מאז, מנגנון זלוף עבר עידון משמעותי. פריי גרובר הציגו ריאות מלאכותיות למשאבות חמצון pulsatile זלוף 2 הרציף. בעוד החוקרים מוקדם בעיקר למד הכליות יונקים-כלומר גדול, חזירים 2 וכלבים 3 -The הדו"ח הראשון של השימוש הכליות עכברוש, על ידי וייס ואח '. , היה ציון דרך בחקר זלוף 4 קטן-יונק-איבר. Schurek et al. דיווח על כך שיש צורך להוסיף אריתרוציטים יונקים אל perfusate אם צינורי כליות מספיקחמצון היה להיות מושגת 5. קריטי עבור ניסויים לטווח ארוך היה המבוא של דיאליזה הרציפה של למאגר על ידי אותה קבוצת המחקר 6. בשנת 2003, Schweda et al. היו הראשונים לדווח כליה perfused תפקודית מבודד העכבר (MIPK) 7, מעודן מאוחר יותר על ידי Rahgozar et al. 18 ו ואח 'לינדל. 14.
למרות שמבחינה טכנית יותר מאתגר מאשר החולדה המבודדת כליות perfused, שימוש MIPK נושא את היתרון של המאפשרים השימוש במגוון רחב של עכברים שעברו שינוי גנטי. מאמר זה מציג את הפרטים של השיטה 'המחברים עבור מרוססת כליות עכבר מבודדות במשך שעה 1. השיטה מאפשרת הערכה הרציפה של קצב זרימת כליות, התנגדות כלי דם, שחרור הורמון, ניתוח גז דם, בדיקת שתן, ואת היישום של סמים. בעקבות ההליך, כליות יכולות להיות מעובד לניתוח מולקולרי ביוכימיים, להיות קבוע עבור מיקרוסקופיה, אוהושתל עכבר נמען (איור 1).
איור 1: סקירה כללית של אפשריות קלט / פלט לכליה perfused מבודד. BGA: ניתוח גז דם. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
טכניקה זו עשויה תקבל תשומת לב גוברת בשנים קרובות, כמו יישומים חדשניים רבים בדיונים מול השחר של זלוף כליות normothermic הממושך לפני ההשתלה (עם או בלי היישום של נוגדות דחייה או תרופות עריכת הגנום) 8, 9, 10 , 11, Bioengineering של הכליות כולו מן הפיגומים decellularized 12, ואת היישום של מינונים גבוהים של צבעי ניאון הדמיה multiphoton 13 </sup>. זהו גם מודל אידיאלי שבה כדי ללמוד את התפקיד של גנים ספציפיים במהלך אי-ספיקת כליות חריפה 14.
פרוטוקול צעד אחר צעד ניתן לאפשר מעבדות אחרות לבצע זלוף כלית עכבר המבודד בהצלחה. ראשית, ההרכב והכין למאגר מצוין. לאחר מכן, הניתוח מתואר בפירוט את השלבים הקריטיים מוצגים. נתונים שלישיים, מוצג מייצגות הכנה מוצלחת: זרימת דם כליות, התנגדות כלי דם, GFR, והפרשה-כל אלקטרוליט שבר המדידות התפקודיות ליום micrographs אלקטרוני הילוכים-הכדאיות של המורפולוגיה של מגזרים נפרון שונים של כליות perfused שוות אחר שעה 1 של זלוף.
העכבר מבודד כליות perfused הוא כלי לחקר תפקוד כליות בסביבה מבוקרת vivo לשעבר עבור שעה 1, לגשר על הפער בין in vivo ניסויים בבעלי חיים שלמים, אשר עשוי להיות פגומים על ידי ההשפעה של גורמים מערכתיים רבים, ובניסויים במבחנה מגזרי נפרון מבודדים או תאים בתרבית, אשר בהכרח …
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank Hans-Joachim Schurek for invaluable scientific advice. The authors would like to thank Monique Carrel and Michèle Heidemeyer for excellent technical assistance, David Penton Ribas and Nourdine Faresse for a critical reading of the manuscript and Carsten Wagner and Jürg Biber for the NaPi-2a antibody. This work was supported by the Swiss National Centre for Competence in Research “Kidney.CH” and by a project grant (310030_143929/1) from the Swiss National Science Foundation.
Perfusion Circuit: | |||
Moist chamber 834/8 | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-2901 | |
Cannular with basket and side port | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-2947 | |
Thermostat TC120-ST5 | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-4544 | |
ISM 827/230V Roller Pump Reglo Analogue | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-0114 | |
Reservoir jacketed for buffer solution 1L | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-3438 | |
Reservoir jacketed for buffer solution 0.5L | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-3436 | |
Pressure Transducer APT300 | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-3862 | |
TAM-D Plugsys Transducer | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-1793 | |
SCP Plugsys servo controller | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-2806 | |
Windkessel | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-3717 | |
HSE-USB data acquisition | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-3330 | |
Low-Flux Dialysator Diacap Polysulfone | B.Braun | 7203525 | |
PE-Tubing for aorta cannulation 1.19mm I.D. x 1.70mm O.D. | Scientific Commodities Inc. | BB31695-PE/8 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Buffer reagents: | |||
Aminoplasmal 10% | B.Braun | 134518064 | |
Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256-25G | |
L-Glutamic acid monosodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G1626-100G | |
L-(-)-Malic acid sodium salt | Sigma-Aldrich | M1125-25G | |
Sodium-L-Lactate | Sigma-Aldrich | L7022-10G | |
alpha-Ketoglutaric acid sodium salt | Sigma-Aldrich | K1875-25G | |
NaCl | Sigma-Aldrich | 31434-1KG-R | |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761-5KG | |
KCl | Sigma-Aldrich | 60130-1KG | |
Urea | Sigma-Aldrich | U5378-500G | |
Creatinine | Sigma-Aldrich | C4255-10G | |
Ampicillin | Roche | 10835242001 | |
MgCl2 * 6H2O | Sigma-Aldrich | M2393-500G | |
D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
CaCl2 * 6H2O | Riedel-de-Haën | 12074 | |
NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638-500G | |
Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S0876-500G | |
Antidiuretic Hormone dDAVP | Sigma-Aldrich | V2013-1MG | |
FITC-Inulin | Sigma-Aldrich | ||
Filter used for erythrocyte filtration | Macherey-Nagel | MN 615 | |
BGA Analysis: | |||
ABL 80 flex | Radiometer Medical ApS | ||
Electron Microscope: | |||
Philips CM100 TEM | FEI |