マウス単離された灌流腎臓テクニック
Summary
マウス単離された灌流腎臓（MIPK）が1時間灌流し、機能的なex vivoでの条件の下でのマウスの腎臓を維持するための技術です。緩衝液および外科技術を詳細に説明します。
Abstract
マウス単離された灌流腎臓（MIPK）が1時間灌流し、機能的なex vivoでの条件の下でのマウスの腎臓を維持するための技術です。これは、摘出された臓器の灌流腎生物工学のための脱細胞化または抗拒絶またはプライム腎臓に高用量におけるゲノム編集する薬剤の投与を含む、将来的には可能かもしれない多くの革新的なアプリケーションのための生理学を研究するための前提条件であります移植のため。灌流の時間の間、腎臓の腎機能を評価することができる、操作、および種々の医薬品を投与することができます。処置後、腎臓を移植することができ、または分子生物学、生化学分析、または顕微鏡検査のために処理しました。
本論文では、灌流液およびマウスの腎臓のex vivo灌流のために必要な外科的技術が記載されています。灌流装置の詳細が与えられ、データは、Vを示して提示されています形態学的読み出しとして異なるネフロンセグメントの機能、透過型電子顕微鏡写真、及び分子の読み出しなどの異なるネフロンセグメントの輸送タンパク質のウェスタンブロットのような腎臓の血流、血管抵抗、及び尿データ：腎臓の調製のiability。
Introduction
臓器の孤立した灌流は、何十年もの間1のための生理学者の間で継続的な努力の対象となっています。技術は、血圧、ホルモン、又は神経のような全身的影響を受けず、臓器の機能を可能にし、検討することができます。カール・エドゥアルドLoebellは、1849年2に、孤立した腎臓の正常灌流を記載した最初であると考えられています。それ以来、灌流装置は、かなりの洗練を受けました。フレイとグルーバーは、連続灌流2のために酸素や拍動ポンプの人工肺を導入しました。初期の研究者は、主に大型哺乳動物、すなわち、豚2と犬3ワイスらによるラット腎臓の使用の-the最初の報告、の腎臓を研究している間。小哺乳類臓器灌流4の研究において画期的な出来事でした。 Schurek ら。十分な尿細管場合は灌流液に、哺乳動物の赤血球を追加することの必要性を報告酸素は5を達成されることになっていました。長期的な実験のためのクリティカルは、同じ研究グループ6によるバッファの連続透析を導入しました。 2003年には、Schweda ら。後でRahgozar らによって洗練機能マウス単離された灌流腎臓（MIPK）7を 、初めて報告しました。 18とリンデルら。 14。
ラット単離された灌流腎臓よりも技術的にはより困難ながら、MIPKの使用は、遺伝的に改変したマウスの広い配列の使用を可能にするという利点を有します。本論文では、1時間単離したマウスの腎臓を灌流するための本手法の詳細を提示しています。この方法は、腎臓の流量、血管抵抗、ホルモン放出、血液ガス分析、尿分析、および薬物の適用の継続的な評価を可能にします。手順の後、腎臓は、分子および生化学的解析のために処理することができる顕微鏡用に固定され、またはレシピエントマウスに移植した （ 図1）。
図1：単離された灌流腎臓に対する可能な入力/出力の概要。 BGA：血液ガス分析。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
この技術は、おそらく多くの革新的なアプリケーションは、移植前に長期の正常体温腎臓灌流の夜明けで議論されているように10、9、8（抗拒絶またはゲノム編集薬の適用の有無にかかわらず）、今後数年間で関心が高まっ受け取ります、11、脱細胞化スカフォールド12から全体腎臓の生体工学、および多光子イメージング13のための蛍光色素の高用量の適用</sup>。また、急性腎障害14中に特定の遺伝子の役割を研究するための理想的なモデルです。
ステップバイステップのプロトコルは、他の研究室が正常に単離したマウス腎臓灌流を行うことができるように与えられています。まず、緩衝液の組成および調製は、指定されています。そして、手術は、詳細に記載されており、重要なステップが示されています。第三に、データが成功した準備を代表するものであり、その提示されている：腎臓の血流量、血管抵抗、糸球体濾過率、およびフラクショナル電解質排泄-すべて灌流腎臓の異なるネフロンセグメントの形態の生存能および透過型電子顕微鏡写真のような官能測定灌流の1時間後に固定。
Protocol
Representative Results
Discussion
灌流腎臓単離されたマウスは、多数の全身要因の影響により欠陥があることがあり、無傷の動物におけるin vivo実験、の間のギャップを埋める、1時間にわたって制御された環境のex vivoで腎機能を研究するためのツールであり、in vitroの実験で必ずしも機能上の無傷の臓器構造の影響を無視孤立ネフロンセグメントまたは培養細胞、。この特定のタスクを実行すると?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Hans-Joachim Schurek for invaluable scientific advice. The authors would like to thank Monique Carrel and Michèle Heidemeyer for excellent technical assistance, David Penton Ribas and Nourdine Faresse for a critical reading of the manuscript and Carsten Wagner and Jürg Biber for the NaPi-2a antibody. This work was supported by the Swiss National Centre for Competence in Research “Kidney.CH” and by a project grant (310030_143929/1) from the Swiss National Science Foundation.
Materials
| Perfusion Circuit: | |||
| Moist chamber 834/8 | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-2901 | |
| Cannular with basket and side port | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-2947 | |
| Thermostat TC120-ST5 | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-4544 | |
| ISM 827/230V Roller Pump Reglo Analogue | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-0114 | |
| Reservoir jacketed for buffer solution 1L | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-3438 | |
| Reservoir jacketed for buffer solution 0.5L | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-3436 | |
| Pressure Transducer APT300 | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-3862 | |
| TAM-D Plugsys Transducer | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-1793 | |
| SCP Plugsys servo controller | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-2806 | |
| Windkessel | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-3717 | |
| HSE-USB data acquisition | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-3330 | |
| Low-Flux Dialysator Diacap Polysulfone | B.Braun | 7203525 | |
| PE-Tubing for aorta cannulation 1.19mm I.D. x 1.70mm O.D. | Scientific Commodities Inc. | BB31695-PE/8 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Buffer reagents: | |||
| Aminoplasmal 10% | B.Braun | 134518064 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256-25G | |
| L-Glutamic acid monosodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G1626-100G | |
| L-(-)-Malic acid sodium salt | Sigma-Aldrich | M1125-25G | |
| Sodium-L-Lactate | Sigma-Aldrich | L7022-10G | |
| alpha-Ketoglutaric acid sodium salt | Sigma-Aldrich | K1875-25G | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 31434-1KG-R | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761-5KG | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 60130-1KG | |
| Urea | Sigma-Aldrich | U5378-500G | |
| Creatinine | Sigma-Aldrich | C4255-10G | |
| Ampicillin | Roche | 10835242001 | |
| MgCl2 * 6H2O | Sigma-Aldrich | M2393-500G | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| CaCl2 * 6H2O | Riedel-de-Haën | 12074 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638-500G | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S0876-500G | |
| Antidiuretic Hormone dDAVP | Sigma-Aldrich | V2013-1MG | |
| FITC-Inulin | Sigma-Aldrich | ||
| Filter used for erythrocyte filtration | Macherey-Nagel | MN 615 | |
| BGA Analysis: | |||
| ABL 80 flex | Radiometer Medical ApS | ||
| Electron Microscope: | |||
| Philips CM100 TEM | FEI |
References
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