Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro.
dopaminerjik nöronların Dendritler almak ve sinaptik girdi, destek aksiyon potansiyeli geri yayılma ve nörotransmitter salınımını iletmek. Bu temel işlevleri anlaşılması bu nöronların bilgi aktarımı ışık tutacaktır. Dendritik patch-kelepçe kayıtları doğrudan dendritler ve altta yatan voltaj kapılı iyon kanallarının elektriksel özelliklerini incelemek imkanı sağlamaktadır. Ancak, bu ince yapılar nedeniyle küçük çaplı yama pipetler kolayca erişilebilir değildir. Bu rapor, akut dilim dopaminerjik nöronların dendrit gelen istikrarlı ve güvenilir kayıtları toplamak için bir adım-adım prosedürü anlatılmaktadır. Elektrofizyolojik ölçümler hücre morfolojisi post hoc geri kazanımı ile bir araya getirilmektedir. Başarılı deneyler dilimleri, çözümleri ve pipetler, kaydedilen yapısı ile temas halinde optik ve pipet istikrar yeterli uyum gelişmiş hazırlık güveniyor. som standart ilkeleriatic yama-kelepçe kayıt dendritler ama pipetle bir yumuşak bir yaklaşım ile uygulanır. Bu çok yönlü teknikler dendritler telaşlı özellikleri hakkında çeşitli soruları için uygulanabilir.
Nöronlar kendi dendritler ağırlıklı sinaptik bilgi almak. Uyarıcı ve aksiyon potansiyelleri (AP) çıkış sinyali olarak uyarılmış bütünleşme sitesine nesil kendi sitesinden yayılan inhibitör sinaptik sinyalleri. Yolda, sinaptik potansiyeller dendrit yapısı ve pasif ve aktif membran özellikleri arasındaki etkileşim hem etkilenir. Bu son derece değişken parametrelerin kombinasyonu nöronlar 1,2 hesaplama gücünü genişletmektedir. Ancak, dendritler küçük çaplı ancak kendi elektriksel özelliklerinin incelenmesini engellemektedir. 6,7 dendritlerindeki – (3 mikron Ø 0.7) patch-kelepçe tekniği 3 sürekli gelişim, son yıllarda optik 4 ve dilim hazırlama 5 için yöntemler arıtma çok ince kayıtları sağlamıştır. Bu yöntemler vardı ve hala büyük ölçüde çeşitli o içinde dendritler heyecanlanma incelemek için kullanılırf nöronlar 8. Doğrudan dendritik kayıtları fonksiyonel özellikleri farklı nöronal bölümlerinde iyon kanallarının 20-22 dağılım 9-19 ve farklılıkları belirlemek için gereklidir. Bu veriler, ışık ve elektron mikroskobu 23,24 kombine immünhistokimya ile tespit edilen iyon kanal dağılımlarının gerekli bir tamamlayıcıdır. Çift somatodendritik kayıtları detaylı pasif kablo modelleri, aksiyon potansiyeli 9,13-15,21,22,25-27 ve nöronların somatodendritik etki boyunca sinaptik potansiyellerin 13,16,18 yayılması yayılmasını keşfetmek elde etmek için uygulanmaktadır 28- 30 ve nöronal entegrasyon 31 zamansal çözünürlüğe araştırmak.
substantia nigra (SN) gibi hareketin kontrolü, ödül ve alışılmış davranışları kodlama gibi çeşitli fonksiyonlar yer alan orta beyinde yer alan bir bölgedir. Belirli nedeniyle dopamin azalmaSN dopaminerjik (DA) nöron kaybı, Parkinson hastalığı 32 mustarip hastalarda gözlenen motor bozuklukları ile bağlantılıdır. dopaminerjik ve GABAerjik nöronlar: nigral devresi iki hücre tipinde oluşmaktadır. İlginçtir, bu nöronlar diğer nöronlardan ayırt birçok özgü özellikleri vardır. DA nöronlar ve bazı GABA nöronların büyük bir bölümünün akson dendritik çardak heterojen (akson taşıyan ve akson-eksik dendritler) 25,26,33 olduğunu belirten bir dendritik sitesinden kaynaklanır. Soma kadar, dendritler başlayarak ve son olarak 34 akson için: bu nöronların morfolojisi bilgi aktarımı dinamik Cajal yaydığı kutuplaşma yasasını takip ettiği nöronların tipik organizasyonu ile bu nedenle tezat. DA nöronlar, aynı zamanda, kendi dendritler 35 dopamin serbest patlama aktivitesi 36 ve NMDA reseptörü plastisite 37 neden olduğu bilinmektedir. dissecBu olayların tion onlar başlatılan sitesinden doğrudan kayıtları olmadan zor olduğunu. hassas konum ve iyon kanallarının fonksiyonel özellikleri ve nigral nöronlar dendritik heyecanlanma ve bilgi transferi rollerine arasındaki ilişki içine anlayışlar kazanmak için, doğrudan dendritik kayıtlar tercih edilen yöntem vardır.
Bu rapor nigral nöronların dendrit ve ilgili post hoc biocytin etiketleme tek ve çift yama-kelepçe kayıtları elde etmek için kullanılabilir detaylı yordam açıklanır. somatik ve dendritik membran yama için temel ilkeler çok benzer. Pratikte, ancak dendritik sitelerden kayıtları somatik kayıtları karşılaştırıldığında özel optimizasyon gerektirir. Başarılı dendritik kayıtları dilimleri, optik optimal ayarı, kayıtların yama pipet ve istikrar nazik yaklaşımı kalitesine güveniyor.
Bu rapor ikili somatodendritik tam hücreli kayıtları ve yerel dendritik kayıtları uygulamak için bir adım-adım protokolü açıklanır. Sırasıyla, postsinaptik potansiyeller zamanla iyon kanalları (yani, İH) etkisini belirlemek ve nigral DA nöronların somatodendritik bölgeleri boyunca iyon kanalı (lH) dağılımını haritalama için kullanışlıdır. Elde edilen elektrofizyolojik ölçümler hücre morfolojisi kurtarmak için hoc histokimya göndermek için birleştirilir. Prosedür substantia nigra bulunan DA nöronları araştırmak için kullanıldı, ancak komşu nigral GABA nöronlar, ventral tegmental alan DA nöronları ya da diğer orta beyin nöronları için genelleştirilebilir. Tüm adımlar da önemli değişiklikler olmadan nigral nöronların dendrit ifade diğer iyon kanallarını incelemek için takip edilebilir. Post hoc görselleştirme akson-rulman ile nöronlar için özellikle uygun olduğunuBöyle nigral nöronlar 25,26, hipokampal oriens-alveus internöronlar 21 ya da bazı CA1 piramidal nöronlar 67 olarak dendritler. İlginçtir, bu özelliği paylaşan nöronlar genellikle 67 düşündüğümden daha yaygın olduğu görülüyor. Morfolojik analizi de elektrotlar ve akson kesin konumunu ortaya koymaktadır. Ikinci tespit immünohistokimya 68,69 kullanılarak akson başlangıç çizgi parçasının (voltaj kontrollü, Na + kanal veya Ankirin G) 'de ifade edilen proteinlerin etiketlenmesine ile optimize edilebilir.
dendritik kayıtları ve sonraki nöronal etiketleme ile toplanan verilerin güvenilirliği her zaman dilim kalitesine bağlıdır. En kusursuz nedenle ihtiyaç doku içindeki hücrelerin canlılığını korumak için uygulanır. Bu dilim hazırlıkları süresince sağlıklı hayvanlardan, yüksek kaliteli araçları ve reaktifler, doku ve buz gibi soğuk sıcaklıklar yeterli oksijenizasyonun nazik işleme ile elde edilir. Kararlı kayıt koşulları sağlıklı nöronların seçimi güveniyor. Bütün hücre modunda, seri direnci, başlangıçta mümkün olduğu kadar düşük olması ve deney boyunca sabit tutulur gerekir. Kayıtların istikrar sürüklenme ve titreşim yoksun yüksek kaliteli manipülatörler hakkında daha fazla bağlıdır. pipet tutucu bağlantısını kontrol ve headstage, mikromanipülatör kabloları gevşek olduğunu kontrol, sıcaklık ya da sahne hareketi ani değişiklikler kaçınarak ve manipülatör mekanizması kontrol: Bu tedirginlikler pipet istikrar optimize ederek azaltılabilir. Çift kayıtlar için, metilsülfat 13,15,21 hücre içi çözelti içinde dahil edilmiştir, ancak glukonat 9,14,25 alternatif olarak kullanılabilir. Bununla birlikte, temel anyon 70,71 potansiyel membran ve bir voltaja bağımlı akımlar 72 değiştirebilir. Hücre içi çözüm ATP, GTP ve physiolo korumak için phosphocreatine ile takviye edilebilirnöronların jik fonksiyonları. Örneğin, bir basınç uygulama yer için ek olarak, pipet çözeltisi bir floresan boya eklenmesi (örneğin, Alexa 594 veya sülforodamin 101 41) yararlı olabilir somatik kayıt sırasında dendritler görselleştirmek için (Ref Şekil 7. 41) ya da elektrikli bir uyarıcı pipet. Hücre bağlı kayıtları için pipet çözümü büyük bir h kaydetmek için yüksek K + konsantrasyonu ve hiçbir Na + içerir. Kayda Değer Na + / K + konsantrasyon oranı geçerli genliği 10, mevcut 11 ters potansiyeli ve h 73 yolluk etkiler. Alternatif olarak, ben h de dışında-çıkışları 10 kullanılarak kaydedilebilir. Bununla birlikte, bu kayıt yapılandırmada, kanalların yakınında hücre içi ortamı tedirgin olabilir. Sonuç olarak, bir voltaja bağımlı aktivasyonuna farklılıklar <karşılaştıran akımları hücre bağlı yamaları ve dış-çıkışları 10 kullanılarak elde zaman sub> h görülmektedir. Nöronların Şişme bazen yama-kelepçe kayıt sırasında karşılaşılan ve sık sık bu tür çözümlerin bileşiminde çözümler 39 veya hatalar hücre içi ve dışı arasında su kalitesinin düşük, güçlü dengesizlik ozmolarite veya pH gibi farklı nedenlerden kaynaklanan bir. elektrofizyolojik kayıtlar kalitesi iyileşti nöronların morfolojisi kalitesi üzerinde doğrudan bir oranına sahiptir. Hücre içi ortamın 14 seyreltme en aza indirmek için, hücre bağlı kaydından sonra – (sayılı referanslarda 6,11 olarak 10 M?. 6) ve tek bir somatik kayıtlar için yüksek direnç somatik pipetler çift kayıtlar için kullanılır. Hücre bağlı kayıt aşağıdaki bütün hücre somatik kayıt nedenle kısa (<10 dk) tutulur. Somatik ve dendritik iki pipetler-dış plasterlerini c uygun kapama için gerekli olanell membran ve hücre morfolojisi sonraki iyileşme. Hücrenin yapısına ek olarak, nörokimyasal içerik kaydedilir nöronlar 59,74 için tespit edilebilir. Örneğin, hücre içi protein tirosin hidroksilaz DA nöronlarının 13 kesin tanımlanması için immunolabeled edilebilir.
DA nöronlar ağırlıklı SN yoğunlaşmıştır SN mevcut çok daha düşük yoğunluğa sahip, pars compactadaki onlar GABA nöronlar 75 daha yüksek bir sayı ile karışmış olan reticulata, pars. DA nöronların hücre gövdesi GABA nöronların genellikle daha büyük olmakla birlikte, kızılötesi-videomikroskopi bu hücrelerin görsel tanımlama belirsiz ve kısmen pars compacta'da opaklık tarafından engellenmektedir. Bu sınırlamaları aşmak için, DA nöronların ön seçim nöronlar (DA nöronlar için TH 65 veya DAT GAD belirli bir popülasyonda bir flüoresan işaretleyici ifade eden transgenik farelerin kullanılması ile kolaylaştırılabilirGABA nöronlar) ve epifloresans aydınlatma. Seçenek olarak ise, bir floresan boya dendritler görselleştirme kolaylaştırmak için somatik elektrot çözelti içinde ilave edilebilir. Floresan hücrenin artan çözünürlük Nipkow dönen disk konfokal 14,22,30 veya IR-DGC 6 kombine iki foton mikroskopi 7 tarafından getirilir. Çeşitli avantajlar DIC göre DGC ile ilgilidir. DIC prizma gerekli değildir Birincisi, IR-DGC görüntü floresan görüntü 49,52,53,76 ile kaplanmış olabilir. İkinci olarak, DGC photostimulation ve 77 optogenetics birleştirilebilir.
dilim hazırlık bir dezavantajı, nöronların bütünlüğünü korumaktır. DA nöronlar üç uzamsal düzlemde 78,79 kendi dendrit uzanır ve bu nedenle, dendritik bölmenin kesme tam dilimleri 80 önlenemez. dilim yönelim seçimi (koronal, yatay ya da para) Sagital bir trade-off. innervasyon ve deneysel tasarım kökeni dilimleri doğru yönünü seçmek için dikkate alınmalıdır.
Doğrudan dendritik yama hücrelerin farklı bölümlerinde fonksiyonel iyon kanallarının dağılımının haritasının çıkartılması kullanılan bir tekniktir. Buna ek olarak, bu teknik, kanallar 20 işlevsel özelliklerinde değişkenliği belirlemek sunar. Bir tamamlayıcısı olarak iyon kanallarının konumu ve yoğunluğu ışık ve elektronik mikroskopi düzeylerinde 17,23 de immünhistokimya kullanılarak tespit edilebilir. Bu yaklaşım aynı zamanda yama pipetler için erişilemez küçük kalibreli yapılarda kanal yoğunluğunu belirlemek için imkanı sunuyor. Bununla birlikte, bu kanallar patch-clamp tekniği kullanılarak kaydedilen kişilerce kıyasla belirgin bir fonksiyonel durum 24 ya da inaktif olabilir. Her iki teknik konumu ve özellikleri tam bir resmini elde etmek için bu nedenle gereklispesifik hücresel bölgesinin 17 iyon kanalları. Voltaj duyarlı boyaların gelişmesiyle birlikte, gerilim görüntüleme birden çok yerde 81 de AP ve nöronlarda EPSPS yayılmasını incelemek için kullanılır olmuştur. Çift patch-kelepçe kayıtları bir alternatif olarak, bu yaklaşım bile yama pipetler için erişilebilir değildir ama sinyal ve ortalamanın doğru kalibrasyon gerektiren ince dendritler için uygulanabilir.
SN ve ventral tegmental alandaki DA nöronlar yaygın fizyolojik ve patofizyolojik bağlamda somatik kayıtları aracılığıyla incelenmiş olmakla birlikte, bunların dendritler fonksiyonel özellikleri her iki durumda da büyük ölçüde bilinmemektedir. Dendritler gelen Yama başarı 13,25,26 ile çeşitli gruplar tarafından nigral dopamin nöronları için uygulanan ve bu güzel hücre içi yapıların 8 heyecanlı özelliklerini incelemek için tercih edilen bir yöntem olmaya devam edilmiştir. Dendritik kayıtları başka bir firsattir sağlamakdilmekte verimliliği ve sinaptik iletim plastisite ve dendritik eksitabiliteye 82,83 plastisite irdelemek.
The authors have nothing to disclose.
Ben konfokal mikroskop, ikinci Axopatch 200B amplifikatör hediye Dr Jacques DESTINE, GIGA-Görüntüleme ile önerileri için yaptığı sürekli destek için Dr. Vincent Seutin, Christelle GILLISSEN ve mükemmel teknik yardım için Laurent Massotte, Dr Jean Defourny ve Sandra Ormenese teşekkür eleştirel yazının okunması için konfokal mikroskop ve Imaris yazılım ve Dr Stephen Freeman paylaşımı için bir platform. Bu çalışma Belçikalı FRS hibe ile desteklenmiştir – FNRS (U.N002.13 ve T.N0015.13) ve Belçikalı Üniversitesi Vakfı'nın desteğiyle (halkla avec le concours de la Fondation Universitaire de Belgique) ile yayınladı.
Double-distillated water | Millipore | Super Q | Resistivity >14 MΩ cm, ideal 18.2 MΩ cm at 25°C, filtered (0.22 µm), https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Super-Q-Plus-Water-Purification-System,MM_NF-C1760 |
Microfilter candles | Robu | Porosity 3, 6 mm or 13 mm diameter | |
Tissue slicer with vibroprobe | Leica | VT1200 | cutting parameters: speed 0.07, amplitude 1.40 |
Tissue slicer | Dosaka | DTK-1000 | cutting parameters: speed 4, frequency 7 |
Razor blades | Gilette | Super Silver | |
Dissection tools | Braun, Aesculap | ||
Reserve chamber | Custom-made | ||
PP beckers | VWR | 213-1725 | 400 ml |
Syringe filter | Merk Millipore | Millex – GV 0,22 µm | |
Cyanoacrylate glue | UHU | "Sekunden Kleber" | liquid glue |
Recording chamber | Luigs & Neumann | Slice mini chamber | |
Horizontal pipette puller | Sutter Instruments | Brown-Flaming P-97 | |
Pipettes | Hilgenberg | 1807524 | 2 mm o.d./1 mm i.d. glass capilaries, ends firepolished, washed |
Dental wax | Coltène/Whaledent | orthodontic tray wax strips | |
Platinum grid | to anchor slices in the recording chamber, custom made with a platinum disk | ||
Microforge | Narishige | MF-830 | to fire-polish pipette tips |
Potassium methyl sulfate | MP Biomedicals | 215481 | |
Biocytin | Molecular probes | B1592 | |
Manometer | GREISINGER electronic | GDH 13 AN | |
Microscope | Zeiss | FS | |
Dodt Gradient Contrast | Luigs & Neumann | ||
Manipulators | Luigs & Neumann | LN Mini 25 | |
Frame grabber | The Imaging Source | DFG/USB2pro | |
Camera | DAGE-MTI | NC-70 | |
Condenser | Zeiss | high numerical aperture condenser working with oil | |
Objective | Zeiss | W Plan Apochromat 441470-9900 VIS-IR | 63x magnification, long-distance, high numerical aperture 1.0 water-immersion objective |
Fourfold-changer | Luigs & Neumann | between the camera and the microscope | |
Black & white video monitor | Sony | SSM-175CE | 16-inch, 850 TV lines, analog |
Sample Bottles, Amber Glass, with Cap | VWR | 215-2409 | to transfer slices from the setup to histology room |
The Axon Guide | Molecular Devices | Book | |
Stimfit | https://github.com/neurodroid/stimfit | Analysis of electrophysiological data | |
Paraformaldehyde | Sigma | 441244 | see SAFETY DATA SHEET and Dangerous Substances Directive (EU) before use |
Well cell culture plate | Greiner-Bio-One | 662160 | for the staining of fixed slices |
Triton X-100 | Merk | 108643 | see SAFETY DATA SHEET and Dangerous Substances Directive (EU) before use |
mouse anti-TH monoclonal primary | Immunostar | 22941 | working concentration: 1/1000 |
goat anti-mouse secondary antibody – Alexa Fluor 568 | Invitrogen – Thermo Fisher Scientific | A-11031 | working concentration: 1/500 |
Normal goat serum | Dako | X0907 | |
ProLong Diamond Antifade | Molecular Probes – Thermo Fisher Scientific | P36961 | |
Fluorescein Avidin DCS | Vector Lab | A-2011 | |
Confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
ImageJ | http://imagej.nih.gov/ij/ | ||
NeuronJ | http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/ | plugin for ImageJ | |
Imaris | http://www.bitplane.com | Reconstruction of biocytin filled neurons | |
Neuromantic | http://www.reading.ac.uk/neuromantic/ | Reconstruction of biocytin filled neurons | |
WinWCP | http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm | Analysis of electrophysiological data |