Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro.
Dendrites dos neurónios dopaminérgicos receber e transmitir entrada sináptica, suporte potencial de ação back-propagação e liberação de neurotransmissores. Entender essas funções fundamentais irá lançar luz sobre a transferência de informações nestes neurônios. Dendríticas gravações de patch-clamp prevê a possibilidade de examinar diretamente as propriedades elétricas dos dendritos e canais de iões dependentes da voltagem subjacentes. No entanto, estas estruturas finas não são facilmente acessíveis para pipetas de patch por causa do seu pequeno diâmetro. Este relatório descreve um procedimento passo-a-passo para recolher gravações estáveis e fiáveis a partir dos dendritos de neurônios dopaminérgicos em fatias aguda. Medidas eletrofisiológicas são combinados com a recuperação post hoc da morfologia celular. experiências bem sucedidas dependem melhorado de preparação de fatias, soluções e pipetas, um ajuste adequado da óptica e estabilidade da pipeta em contacto com a estrutura gravada. princípios padrão de somatic gravação de patch-clamp são aplicados aos dendritos, mas com uma abordagem mais suave da pipeta. Estas técnicas versáteis podem ser implementadas para abordar várias questões relativas às propriedades excitáveis de dendrites.
Os neurónios receber informações sináptica predominantemente nas suas dendrites. Excitatórios e sinais inibitórios sinápticas espalhados do seu local de produção para o local de integração onde potenciais de acção (APs) são evocadas como o sinal de saída. Em seu caminho, potenciais sinápticos são influenciados tanto pela estrutura dos dendritos e da interação entre propriedades da membrana passivos e ativos. A combinação destes parâmetros altamente variáveis aumenta o poder computacional de neurónios 1,2. No entanto, o pequeno diâmetro de dendritos dificulta no entanto, o estudo das suas propriedades eléctricas. O contínuo desenvolvimento da técnica de patch-clamp 3, a óptica 4 e aperfeiçoamento de métodos para a preparação fatia 5 durante as últimas décadas têm permitido gravações de muito fina (0,7-3 mm Ø) dendrites 6,7. Estes métodos eram, e são, em grande parte, ainda usado para examinar a excitabilidade dos dendritos em uma varieneurônios F 8. Gravações dendríticas diretos são essenciais para determinar a distribuição 9-19 e as diferenças nas propriedades funcionais 20-22 de canais iônicos em compartimentos neuronais distintas. Estes dados são o complemento necessário das distribuições de canais de iões detectados com imunohistoquímica combinada à luz e microscopia eletrônica 23,24. Gravações somatodendríticos dupla têm sido implementadas para explorar a propagação dos potenciais de ação 9,13-15,21,22,25-27 e disseminação de potenciais sinápticos 13,16,18 ao longo do domínio somatodendrítico de neurônios, obtenção de modelos de cabos passivos detalhados 28- 30 e investigar a resolução temporal de integração neuronal 31.
A substância negra (SN) é uma região localizada no meio do cérebro envolvida em várias funções, tais como o controlo do movimento, a codificação de recompensa e comportamentos habituais. A diminuição de dopamina devido à específicaperda de dopaminérgicos (DA) neurónios no SN está associado com os distúrbios motores observadas em pacientes que sofrem de doença de Parkinson 32. O circuito nigral é composto por dois tipos de células principais: dopaminérgicos e GABAérgicos neurónios. Curiosamente, esses neurônios têm várias características específicas que os distinguem de outros neurônios. O axônio de uma grande proporção de neurônios DA e alguns neurônios GABA origina de um site dendrítica, indicando que o mandril dendrítica é heterogênea (axônio-rolamento e dendrites-falta axônio) 25,26,33. A morfologia desses neurônios contrasta, por conseguinte, com a organização típica de neurônios em que a transferência de informações segue a lei da polarização dinâmica emitida por Cajal: a partir de dendrites, a soma e, finalmente, para axônio 34. Neurónios DA também são conhecidos para a libertação de dopamina a partir de suas dendrites 35, gerar actividade de rotura 36 e 37 plasticidade NMDA-receptor. a dissecçãoção desses fenômenos é evasivo, sem gravações directos a partir do local onde eles são iniciados. Para obter conhecimentos sobre a relação entre a localização precisa e propriedades funcionais dos canais de iões e o seu papel na excitabilidade e informações dendrítica transferência em neurónios da substância negra, gravações dendríticas directos são o método de escolha.
Este relatório descreve um procedimento detalhado que pode ser usado para obter gravações de patch-clamp simples e dupla de dendrites dos neurónios da substância negra eo hoc biocitina rotulagem lugar correspondente. Os princípios básicos para remendar o somático e da membrana dendrítica são muito semelhantes. Praticamente no entanto, as gravações de sites dendríticas requerem otimização específica em comparação com gravações somáticas. gravações dendríticas sucedidas dependem da qualidade das fatias, ajuste ideal da óptica, abordagem suave da pipeta patch e estabilidade das gravações.
Este relatório descreve um protocolo passo-a-passo para implementar gravações de célula inteira somatodendríticos duplas e gravações dendríticas locais. É útil para a determinação da influência de canais iónicos (isto é, I h) sobre o decurso de tempo de potenciais pós-sinápticos e mapeamento da distribuição do canal de iões (I h) ao longo do domínio somatodendrítico de neurónios da substância negra de DA, respectivamente. Resultantes medidas eletrofisiológicas são combinados para deixar histoquímica hoc para recuperar a morfologia das células. O procedimento foi utilizado para investigar neurónios DA localizados na substantia nigra, mas podem ser generalizados para os neurónios da substância negra vizinhos GABA, área tegmental ventral neurónios DA ou outros neurónios do mesencéfalo. Todas as etapas também podem ser seguidas para examinar outros canais iônicos expressos em dendrites dos neurónios da substância negra, sem modificações importantes. Visualização post hoc é particularmente pertinente para os neurônios com axônio-bearingdendrites, como neurônios da substância negra 25,26, hipocampo interneurônios Oriens-alveus 21 ou alguns neurônios piramidais CA1 67. Curiosamente, os neurônios que partilham esta característica parece ser mais comum do que geralmente se pensa 67. A análise morfológica revela também a posição precisa dos eletrodos e axônio. A detecção do último pode ser otimizado pela rotulagem de proteínas expressas no segmento axônio inicial (canais de Na + dependentes de voltagem ou Ankyrin G) usando imunohistoquímica 68,69.
A fiabilidade dos dados recolhidos com as gravações dendríticas e rotulagem neuronal subsequente, invariavelmente, depende da qualidade fatia. Esforço máximo deve, pois, ser aplicado para preservar a viabilidade das células no tecido. Isto é conseguido com a manipulação suave de animais saudáveis, ferramentas de alta qualidade e reagentes, oxigenação suficiente das temperaturas de tecidos e geladas ao longo da preparação de fatias. condições de gravação estáveis contam com a seleção de neurônios saudáveis. No modo de célula inteira, resistência em série inicialmente deverá ser tão baixo quanto possível e mantida constante ao longo da experiência. A estabilidade das gravações é mais dependente manipuladores de alta qualidade desprovidas de deriva e vibrações. Estas perturbações podem ser reduzidas através da optimização da estabilidade pipeta: verificar a ligação ao suporte da pipeta e a headstage, controlar que os cabos são micromaniplador folga, evitando alterações bruscas de temperatura ou o movimento fase e verificar o mecanismo do manipulador. Para as gravações dupla, metilsulfato 13,15,21 foi incluído na solução intracelular, mas gluconato 9,14,25 pode ser alternativamente empregue. No entanto, o principal anião podem alterar o potencial de membrana 70,71 e algumas correntes dependentes de voltagem 72. solução intracelular pode ser suplementado com ATP, GTP e fosfocreatina para preservar a physiolofunções gicos dos neurônios. Além disso, a adição de um corante fluorescente na solução de pipeta (por exemplo, Alexa 594 ou Sulforodamina 101 41) para visualizar os dendritos durante uma gravação somática pode ser útil, por exemplo para colocar um pedido de pressão (Figura 7 em Ref. 41) ou um estimulante eléctricos pipeta. A solução de pipeta para gravações ligado à célula contém uma alta concentração de K + e nenhum Na + para gravar grande I h. Digno de nota a proporção da concentração de Na + / K + influencia a amplitude da corrente 10, o potencial de inversão da corrente 11 e a propagação de h I 73. Como alternativa, eu h também podem ser gravados utilizando fora-outs 10. Nesta configuração de gravação no entanto, o meio intracelular na proximidade dos canais pode ser perturbado. Por conseguinte, as diferenças na activação dependente de voltagem de I <sub> h é observado quando as correntes comparando obtidos utilizando manchas ligado à célula e fora-outs 10. Inchaço dos neurônios é ocasionalmente encontrada durante a gravação de patch-clamp, e muitas vezes surge de causas distintas, tais como a baixa qualidade da água, forte desequilíbrio da osmolaridade ou pH entre a soluções de 39 ou erros intra e extracelular na composição de soluções. A qualidade dos registos electrofisiolicos tem uma incidência directa sobre a qualidade da morfologia de neurónios recuperados. Alta resistência pipetas somáticas são utilizados para gravações duplas (6 – 10 mohms, como nas refs 6,11.) E para gravações somáticos simples após gravações ligado de células para minimizar a diluição do meio intracelular 14. A gravação somática de célula completa após a gravação ligado de células é, portanto, mantido curto (<10 min). patches de fora para fora de ambos os somáticas e dendríticas pipetas são essenciais para o fecho do cmembrana ell e subsequente recuperação da morfologia celular. Além disso a estrutura da célula, o conteúdo neuroquímica pode ser determinado para os neurónios gravados 59,74. Por exemplo, a proteína intracelular tirosina-hidroxilase pode ser immunolabeled para a identificação inequívoca dos neurónios DA 13.
Neurónios DA concentram-se principalmente no SN pars compacta, com uma densidade muito mais baixa presentes no SN pars reticulata, onde eles são misturados com um maior número de neurónios GABA 75. Enquanto o corpo da célula dos neurónios DA é muitas vezes maior do que a de neurónios GABA, a identificação visual destas células com IR-videomicroscopia é incerto e parcialmente impedida pela opacidade da pars compacta. Para ultrapassar estas limitações, a pré-selecção de neurónios DA pode ser facilitada pela utilização de ratos transgénicos que expressam um marcador fluorescente, numa população específica de neurónios (TH 65 ou DAT para neurónios DA, GADpara os neurônios GABA) e iluminação de epifluorescência. Alternativamente, um corante fluorescente pode ser incluída na solução do eléctrodo somática para facilitar a visualização dos dendritos. O aumento da resolução da célula fluorescente é trazida por Nipkow confocal disco giratório 14,22,30 ou microscopia de dois fótons 7 combinados para IR-DGC 6. Várias vantagens estão relacionadas com DGC em comparação com DIC. Em primeiro lugar, na forma de prismas DIC não são requeridos, a imagem IR-DGC pode ser coberto com uma 49,52,53,76 imagem de fluorescência. Em segundo lugar, a DGC pode ser combinado com fotoestimulação e Optogenetics 77.
Uma desvantagem de preparação fatia é a preservação da integridade dos neurónios. Neurónios DA alargar as suas dendrites nos três planos do espaço e, portanto, 78,79 truncamento do compartimento dendríticas não pode ser completamente evitada em fatias 80. A escolha da orientação de fatias (coronal, horizontal ou para-sagital) é um trade-off. A origem da inervação eo delineamento experimental devem ser considerados para selecionar a orientação da direita de fatias.
patching dendrítica directa é a técnica utilizada para mapear a distribuição de canais de iões funcionais nos diferentes compartimentos das células. Além disso, esta técnica oferece para determinar a variabilidade nas propriedades funcionais dos canais 20. Como complemento a localização e densidade de canais de iões pode ser verificado usando imuno-histoquímica para a luz e microscopia eletrônica níveis 17,23. Essa abordagem também oferece a possibilidade de determinar a densidade de canais em estruturas de pequeno calibre que são inacessíveis para pipetas de patch. No entanto, estes canais pode estar em um estado funcional distinta 24 ou mesmo inativa em comparação com os registados utilizando técnicas de patch-clamp. Ambas as técnicas são, portanto, necessário para obter uma imagem completa da localização e propriedades decanais iônicos em uma região celular específica 17. Com o desenvolvimento de corantes sensíveis à voltagem, imagiologia de tensão foi usado para examinar a propagação de EPSPs de APs e em neurónios em vários locais 81. Como uma alternativa a dupla gravações de patch-clamp, esta abordagem pode ainda ser implementado por dendrites finas que não são acessíveis para pipetas patch, mas exigem uma calibração precisa do sinal e média.
Enquanto neurónios DA na SN e área tegmental ventral são amplamente investigada por meio de gravações somáticas no contexto fisiológico e fisiopatológico, as propriedades funcionais das suas dendrites permanece largamente desconhecido em ambas as condições. Aplicação de patches de dendrites foi implementado para os neurónios dopaminérgicos da substância negra por vários grupos com sucesso 13,25,26 e continua a ser o método de escolha para dissecar propriedades excitáveis destas estruturas subcelulares finas 8. gravações dendríticas proporcionar uma maior opportuComunidade de fiscalizar a eficiência ea plasticidade da transmissão sináptica e da plasticidade da excitabilidade dendrítica 82,83.
The authors have nothing to disclose.
Agradeço ao Dr. Vincent Seutin por seu apoio constante, Christelle Gillissen e Laurent Massotte para excelente assistência técnica, Drs Jean Defourny e Sandra Ormenese para conselhos com o microscópio confocal, Dr Jacques destinar para o dom do segundo amplificador Axopatch 200B, o GIGA-Imaging plataforma para compartilhar o microscópio confocal e software Imaris e Dr. Stephen Freeman pela leitura crítica do manuscrito. Este trabalho foi apoiado por subsídios da FRS belgas – FNRS (U.N002.13 e T.N0015.13) e publicado com o apoio da Fundação Universidade belga (Publié avec le concours de la Fondation Universitaire de Belgique).
Double-distillated water | Millipore | Super Q | Resistivity >14 MΩ cm, ideal 18.2 MΩ cm at 25°C, filtered (0.22 µm), https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Super-Q-Plus-Water-Purification-System,MM_NF-C1760 |
Microfilter candles | Robu | Porosity 3, 6 mm or 13 mm diameter | |
Tissue slicer with vibroprobe | Leica | VT1200 | cutting parameters: speed 0.07, amplitude 1.40 |
Tissue slicer | Dosaka | DTK-1000 | cutting parameters: speed 4, frequency 7 |
Razor blades | Gilette | Super Silver | |
Dissection tools | Braun, Aesculap | ||
Reserve chamber | Custom-made | ||
PP beckers | VWR | 213-1725 | 400 ml |
Syringe filter | Merk Millipore | Millex – GV 0,22 µm | |
Cyanoacrylate glue | UHU | "Sekunden Kleber" | liquid glue |
Recording chamber | Luigs & Neumann | Slice mini chamber | |
Horizontal pipette puller | Sutter Instruments | Brown-Flaming P-97 | |
Pipettes | Hilgenberg | 1807524 | 2 mm o.d./1 mm i.d. glass capilaries, ends firepolished, washed |
Dental wax | Coltène/Whaledent | orthodontic tray wax strips | |
Platinum grid | to anchor slices in the recording chamber, custom made with a platinum disk | ||
Microforge | Narishige | MF-830 | to fire-polish pipette tips |
Potassium methyl sulfate | MP Biomedicals | 215481 | |
Biocytin | Molecular probes | B1592 | |
Manometer | GREISINGER electronic | GDH 13 AN | |
Microscope | Zeiss | FS | |
Dodt Gradient Contrast | Luigs & Neumann | ||
Manipulators | Luigs & Neumann | LN Mini 25 | |
Frame grabber | The Imaging Source | DFG/USB2pro | |
Camera | DAGE-MTI | NC-70 | |
Condenser | Zeiss | high numerical aperture condenser working with oil | |
Objective | Zeiss | W Plan Apochromat 441470-9900 VIS-IR | 63x magnification, long-distance, high numerical aperture 1.0 water-immersion objective |
Fourfold-changer | Luigs & Neumann | between the camera and the microscope | |
Black & white video monitor | Sony | SSM-175CE | 16-inch, 850 TV lines, analog |
Sample Bottles, Amber Glass, with Cap | VWR | 215-2409 | to transfer slices from the setup to histology room |
The Axon Guide | Molecular Devices | Book | |
Stimfit | https://github.com/neurodroid/stimfit | Analysis of electrophysiological data | |
Paraformaldehyde | Sigma | 441244 | see SAFETY DATA SHEET and Dangerous Substances Directive (EU) before use |
Well cell culture plate | Greiner-Bio-One | 662160 | for the staining of fixed slices |
Triton X-100 | Merk | 108643 | see SAFETY DATA SHEET and Dangerous Substances Directive (EU) before use |
mouse anti-TH monoclonal primary | Immunostar | 22941 | working concentration: 1/1000 |
goat anti-mouse secondary antibody – Alexa Fluor 568 | Invitrogen – Thermo Fisher Scientific | A-11031 | working concentration: 1/500 |
Normal goat serum | Dako | X0907 | |
ProLong Diamond Antifade | Molecular Probes – Thermo Fisher Scientific | P36961 | |
Fluorescein Avidin DCS | Vector Lab | A-2011 | |
Confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
ImageJ | http://imagej.nih.gov/ij/ | ||
NeuronJ | http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/ | plugin for ImageJ | |
Imaris | http://www.bitplane.com | Reconstruction of biocytin filled neurons | |
Neuromantic | http://www.reading.ac.uk/neuromantic/ | Reconstruction of biocytin filled neurons | |
WinWCP | http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm | Analysis of electrophysiological data |