Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro.
多巴胺能神经元树突接收和传达突触输入,支持动作电位反向传播和神经递质的释放。了解这些基本的功能将在这些神经元的信息传递线索。树突状膜片钳记录提供了可能直接检查树突和底层电压门控离子通道的电性能。然而,这些精细结构由于其小直径的不容易接触到的补丁吸管。这份报告描述了一步一步的过程来收集急性片多巴胺能神经元的树突稳定可靠的录音。电生理测量结合的细胞形态的事后恢复。成功的实验依靠改进的切片,解决方案和移液管,在与记录的结构相接触的光学元件和吸液管的稳定性的充分调整准备。索姆标准原则ATIC膜片钳记录被施加到树突但用吸管的温和的方法。这些多功能的技术可以被实现为处理有关枝晶的可激发性的各种问题。
神经元主要是收到他们的树突突触的信息。兴奋性和从它们产生的部位扩散到积分位点,其中动作电位(AP)的被诱发,作为输出信号抑制性突触信号。在他们的方式,突触电位通过树突的结构和被动和主动膜特性之间的相互作用的影响。这些高度可变参数的组合扩大的神经元1,2的计算能力。然而,树突的小直径却阻碍了其电性能的研究。 ( – 3微米直径0.7)树突6,7膜片钳技术3的不断发展,光学4对切片准备5种方法细化过去几十年中已经非常薄启用录音。这些方法,并且,仍然主要用于检查树突的兴奋性在各种Ø˚F元8。直接树突录音是必不可少确定的功能特性在不同的神经元隔间离子通道20-22的分布9-19和差异。这些数据与免疫相结合,光学和电子显微镜检测23,24离子通道分布的必要补充。双somatodendritic录音已实施探索动作电位9,13-15,21,22,25-27并沿神经元的somatodendritic域突触电位13,16,18蔓延的传播,获取详细的被动电缆型号28- 30,并调查神经集成31的时间分辨率。
黑质(SN),是位于参与多种功能,如运动的控制下,奖励和习惯行为的编码中脑区域。多巴胺由于具体的减少在SN多巴胺(DA)神经元的损失与在帕金森氏病32患者中观察到的运动障碍有关。黑质电路由两个主要的细胞类型:多巴胺能和GABA能神经元。有趣的是,这些神经元具有区别于其他神经元的一些特定功能。大比例的DA神经元和一些GABA神经元的轴突从树突站点指示树突是多相(轴突轴承和轴突缺失树突)25,26,33起源。从树突开始,到体细胞,最后到轴突34:这些神经元的形态与神经元的典型组织,其中信息传送遵循Cajal间发射的动态偏振法因此对比。还已知多巴胺神经元从其树突35释放多巴胺,产生爆裂活动36和NMDA受体可塑性37。该dissec这些现象是化不从他们的起始位点直接录音难以捉摸。到洞察的精确位置和离子通道的功能特性以及它们在黑质神经元的树突的兴奋性和信息传输的作用之间的关系,直接树突录音是选择的方法。
本报告描述了可用于从黑质神经元的树突和相应的事后生物胞素标记获得单和双膜片钳记录的详细过程。用于修补体细胞和树突状膜的基本原理非常相似。实际上然而,从树枝状站点录音要求相比于体录音特定优化。成功的树突录音靠片,光学器件的优化调整,在记录的膜片吸管和稳定性的温和方法的质量。
这份报告描述了一个一步一步的协议实现双somatodendritic全细胞记录和当地树突录音。它是用于确定对突触后电位的时间过程离子通道( 即,I H)的影响,并映射离子通道(Ⅰh)条沿黑质多巴胺神经元的somatodendritic域的分布,分别是有用的。导致电测量相结合, 事后组织化学恢复细胞形态。该程序是用来调查位于黑质多巴胺神经元,但可以概括为相邻黑质的GABA神经元,腹侧被盖区DA神经元或其它脑神经元。所有的步骤,也可以跟着审查黑质神经元的树突没有重要的修改表示其他离子通道。 事后可视化是用于与轴突轴承神经元特别相关树突,如黑质细胞25,26,海马东方明珠Oriens-alveus的interneurons 21或一些CA1神经元67。有趣的是,神经元共用这一功能似乎比一般认为67更常见。形态分析也揭示了电极和轴突的精确位置。后者的检测可以通过使用免疫组68,69轴突起始段(电压门控Na +通道或锚蛋白G)的表达的蛋白质的标记进行优化。
树突状记录和随后的神经元标记收集到的数据的可靠性不变地依赖于片质量。因此最大的努力需要施加到组织内保持细胞的活力。这是用柔和处理健康动物,高品质的工具和试剂,组织和冰冷的温度足够的氧合的整个切片的制备取得。稳定的拍摄条件依赖于健康的神经元的选择。在全细胞模式,串联电阻最初应尽可能低,并保持在整个实验常数。录音的稳定性还取决于高质量的机械手缺乏漂移和振动。检查以吸管持有人的连接和探头,控制了显微电缆松弛,避免温度或舞台动作的突然变化和检查机械手的机制:可以通过优化移液器稳定性可以减少这些干扰。对于双记录,甲基13,15,21已被包含在细胞内的解决方案,但葡糖9,14,25或者可使用。然而,主要的阴离子可以改变膜电位70,71和某些电压依赖性电流72。细胞内溶液可以补充与ATP,GTP和磷酸保存physiolo神经元的gical功能。另外,在移液管溶液中加入荧光染料( 例如 ,Alexa的594或磺酰罗丹明101 41),以一个躯体记录期间形象化树突可以是有用的,例如以放置压力施加(在参考文献的图7。41)或电刺激吸管。对细胞附着的录音吸管解决方案包含一个高K +浓度,没有Na +的记录高我 小时 。值得注意的的 Na + / K +浓度比影响电流振幅10,电流11的反转电位和I H 73选通。可替代地,I H也可以用外奏10记录。然而,在该记录结构中,在通道的邻近的细胞内环境可以扰动。因此,在I的电压依赖性活化的差异<在使用细胞贴附补丁和外困10获得比较电流子> h的观察。神经元的肿胀膜片钳记录期间偶尔遇到,并且经常从不同的原因产生诸如水的溶液中的组合物中的低质量,强不平衡克分子渗透压浓度或pH的细胞内和细胞外溶液39或误差之间。电生理学记录的质量对回收的神经元的形态学的质量有直接的发病率。高电阻体移液器用于双重记录(6 – 10MΩ,如在6,11参考文献)和单体录音细胞附着的记录之后,以尽量减少细胞内环境14的稀释。因此,细胞贴附记录之后的全细胞体记录被保持短(<10分钟)。无论从体细胞和树突移液器外面向外补丁是针对C的正确的关闭至关重要ELL膜和细胞形态的随后回收。除了细胞的结构,神经化学含量可以为记录神经元59,74来确定。例如,细胞内蛋白质酪氨酸羟化酶可以免疫标记为多巴胺神经元13的明确鉴定。
DA神经元主要集中在SN致密部,与目前在SN相当低的密度网状部,在那里它们被混合使用一个较大的数字神经元GABA 75。而多巴胺神经元的细胞体是经常比GABA神经元大时,这些细胞的视觉识别与IR电视显微镜是不确定的,由致密部的不透明度部分阻碍。克服这些限制,多巴胺神经元的预选择可通过在神经元(TH 65或DAT为多巴胺神经元,GAD的特定人群表达荧光标记的使用转基因小鼠来促进为GABA神经元)和落射荧光照明。替代地,荧光染料可被包含在体电极的溶液,以促进枝晶的可视化。增加了荧光细胞的分辨率由尼普科夫旋转盘共聚焦14,22,30或组合以红外DGC 6双光子显微镜7带来的。几个优点相比,DIC有关DGC。首先,作为不需要DIC棱镜,对IR-DGC图像可以与荧光图像49,52,53,76重叠。第二,DGC可以与光刺激和光遗传学77相结合。
切片准备的一个缺点是神经元的完整性的保护。多巴胺神经元中的三个空间平面78,79延伸的树突和因此树枝状隔室的截断不能完全在片80避免。片的取向的选择(冠状,水平或对矢状)是一个权衡。神经支配和实验设计的原点,必须考虑选择片的正确方向。
直接树突修补是用于功能性离子通道的分布图中的细胞的不同区室的技术。此外,这种技术提供了确定在通道20的功能特性的可变性。作为一种补充的离子通道的位置和密度可通过免疫组织化学在光学及电子显微镜的水平17,23来确定。这种方法还提供了确定未至的补丁移液器小口径结构信道密度的可能性。然而,这些信道可能是在一个不同的功能状态24或甚至不活动相比,那些使用膜片钳技术记录。这两种技术,因此需要获取的位置和属性的完整图象在一个特定的蜂窝区17的离子通道。与电压敏感染料的发展,电压成像已经被用于检查AP和神经元EPSPS的在多个位置81的传播。作为替代双膜片钳记录,这种方法甚至可以为薄树突不在修补移液器访问,但必要的信号,并平均化的精确校准实现。
而在SN和腹侧被盖区的多巴胺神经元被广泛经由在生理和病理上下文躯体录音调查,其树突的功能特性保持在这两个条件是未知。从树突修补已实施黑质多巴胺神经元由几组成功13,25,26和仍然是首选的剖析这些细微的亚细胞结构8的兴奋性的方法。树突状录音提供进一步opportu无穷大审议的效率和突触传递的可塑性和树突兴奋82,83的可塑性。
The authors have nothing to disclose.
我感谢文森特Seutin博士的一贯支持,克里斯泰勒Gillissen和Laurent Massotte优秀的技术援助,博士让Defourny和桑德拉Ormenese与共聚焦显微镜,雅克注定博士第二Axopatch 200B放大器的礼物,GIGA-成像建议共享平台的共聚焦显微镜和软件了Imaris和斯蒂芬·弗里曼博士批判地阅读手稿。 FNRS(U.N002.13和T.N0015.13)和与之相配套的比利时大学基金会(PubliéAVEC乐竞赛德拉基金会区大学比利时)公布的 – 这项工作是由来自比利时FRS资助。
Double-distillated water | Millipore | Super Q | Resistivity >14 MΩ cm, ideal 18.2 MΩ cm at 25°C, filtered (0.22 µm), https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Super-Q-Plus-Water-Purification-System,MM_NF-C1760 |
Microfilter candles | Robu | Porosity 3, 6 mm or 13 mm diameter | |
Tissue slicer with vibroprobe | Leica | VT1200 | cutting parameters: speed 0.07, amplitude 1.40 |
Tissue slicer | Dosaka | DTK-1000 | cutting parameters: speed 4, frequency 7 |
Razor blades | Gilette | Super Silver | |
Dissection tools | Braun, Aesculap | ||
Reserve chamber | Custom-made | ||
PP beckers | VWR | 213-1725 | 400 ml |
Syringe filter | Merk Millipore | Millex – GV 0,22 µm | |
Cyanoacrylate glue | UHU | "Sekunden Kleber" | liquid glue |
Recording chamber | Luigs & Neumann | Slice mini chamber | |
Horizontal pipette puller | Sutter Instruments | Brown-Flaming P-97 | |
Pipettes | Hilgenberg | 1807524 | 2 mm o.d./1 mm i.d. glass capilaries, ends firepolished, washed |
Dental wax | Coltène/Whaledent | orthodontic tray wax strips | |
Platinum grid | to anchor slices in the recording chamber, custom made with a platinum disk | ||
Microforge | Narishige | MF-830 | to fire-polish pipette tips |
Potassium methyl sulfate | MP Biomedicals | 215481 | |
Biocytin | Molecular probes | B1592 | |
Manometer | GREISINGER electronic | GDH 13 AN | |
Microscope | Zeiss | FS | |
Dodt Gradient Contrast | Luigs & Neumann | ||
Manipulators | Luigs & Neumann | LN Mini 25 | |
Frame grabber | The Imaging Source | DFG/USB2pro | |
Camera | DAGE-MTI | NC-70 | |
Condenser | Zeiss | high numerical aperture condenser working with oil | |
Objective | Zeiss | W Plan Apochromat 441470-9900 VIS-IR | 63x magnification, long-distance, high numerical aperture 1.0 water-immersion objective |
Fourfold-changer | Luigs & Neumann | between the camera and the microscope | |
Black & white video monitor | Sony | SSM-175CE | 16-inch, 850 TV lines, analog |
Sample Bottles, Amber Glass, with Cap | VWR | 215-2409 | to transfer slices from the setup to histology room |
The Axon Guide | Molecular Devices | Book | |
Stimfit | https://github.com/neurodroid/stimfit | Analysis of electrophysiological data | |
Paraformaldehyde | Sigma | 441244 | see SAFETY DATA SHEET and Dangerous Substances Directive (EU) before use |
Well cell culture plate | Greiner-Bio-One | 662160 | for the staining of fixed slices |
Triton X-100 | Merk | 108643 | see SAFETY DATA SHEET and Dangerous Substances Directive (EU) before use |
mouse anti-TH monoclonal primary | Immunostar | 22941 | working concentration: 1/1000 |
goat anti-mouse secondary antibody – Alexa Fluor 568 | Invitrogen – Thermo Fisher Scientific | A-11031 | working concentration: 1/500 |
Normal goat serum | Dako | X0907 | |
ProLong Diamond Antifade | Molecular Probes – Thermo Fisher Scientific | P36961 | |
Fluorescein Avidin DCS | Vector Lab | A-2011 | |
Confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
ImageJ | http://imagej.nih.gov/ij/ | ||
NeuronJ | http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/ | plugin for ImageJ | |
Imaris | http://www.bitplane.com | Reconstruction of biocytin filled neurons | |
Neuromantic | http://www.reading.ac.uk/neuromantic/ | Reconstruction of biocytin filled neurons | |
WinWCP | http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm | Analysis of electrophysiological data |