Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro.
Dendritas de las neuronas dopaminérgicas reciben y transmiten la entrada sináptica, el apoyo potencial de acción de propagación hacia atrás y la liberación de neurotransmisores. La comprensión de estas funciones fundamentales arrojará luz sobre la transferencia de información en estas neuronas. patch-clamp grabaciones dendríticas ofrecen la posibilidad de examinar directamente las propiedades eléctricas de las dendritas y los canales iónicos dependientes de voltaje subyacentes. Sin embargo, estas estructuras finas no son de fácil acceso para las pipetas de parche debido a su pequeño diámetro. Este informe describe un procedimiento paso a paso para recoger grabaciones estables y fiables a partir de las dendritas de las neuronas dopaminérgicas en rodajas agudas. Las medidas electrofisiológicas se combinan con la recuperación post hoc de la morfología celular. experimentos exitosos se basan en la mejora de la preparación de las rebanadas, soluciones y pipetas, el ajuste adecuado de la óptica y la estabilidad de la pipeta en contacto con la estructura grabada. principios estándar de somgrabación de patch-clamp ATIC se aplican a las dendritas pero con un enfoque más suave de la pipeta. Estas técnicas versátiles pueden ser implementadas para abordar diversas cuestiones relativas a las propiedades de las dendritas excitables.
Las neuronas reciben información sináptica predominantemente en sus dendritas. Excitatorios e inhibitorios señales sinápticas extendido de su sitio de generación en el sitio de integración, donde los potenciales de acción (AP) son evocados como la señal de salida. En su camino, los potenciales sinápticos están influenciados tanto por la estructura de las dendritas y la interacción entre propiedades de la membrana pasivos y activos. La combinación de estos parámetros muy variables ensancha la potencia de cálculo de las neuronas 1,2. Sin embargo, el pequeño diámetro de las dendritas impide sin embargo el estudio de sus propiedades eléctricas. El continuo desarrollo de la técnica de patch-clamp 3, la óptica 4 y el perfeccionamiento de los métodos para la preparación rebanada 5 durante las últimas décadas han permitido a las grabaciones de muy delgada (0,7 – 3 m Ø) 6,7 dendritas. Estos métodos eran, y son, en gran medida todavía utilizan para examinar la excitabilidad de las dendritas en una variedad of 8 neuronas. Grabaciones directas dendríticas son esenciales para determinar la distribución 9-19 y las diferencias en las propiedades funcionales de los canales iónicos 20-22 en compartimentos neuronales distintas. Estos datos son el complemento necesario de la distribución de los canales iónicos detectada por inmunohistoquímica, combinado a la luz y microscopía electrónica 23,24. Grabaciones somatodendríticos duales se han implementado para explorar la propagación de los potenciales de acción 9,13-15,21,22,25-27 y propagación de los potenciales sinápticos 13,16,18 a lo largo del dominio somatodentrítica de las neuronas, la obtención de modelos detallados de cable pasivas 28- 30 e investigar la resolución temporal de la integración neuronal 31.
La sustancia negra (SN) es una región situada en el cerebro medio implicado en diversas funciones tales como el control de movimiento, la codificación de la recompensa y comportamientos habituales. La disminución de la dopamina debido a la específicala pérdida de neuronas dopaminérgicas (DA) en el SN está asociado con los trastornos motores observados en los pacientes que sufren de la enfermedad 32 de Parkinson. El circuito nigral se compone de dos tipos de células principales: dopaminérgicas y GABAérgicas neuronas. Curiosamente, estas neuronas tienen varias características que las distinguen de otras neuronas. El axón de una gran proporción de las neuronas DA y algunas neuronas GABA origina a partir de un sitio dendríticas que indica que el árbol dendrítico es heterogénea (axón-cojinete y dendritas axón-carente) 25,26,33. La morfología de estas neuronas, por lo tanto contrasta con la organización típica de las neuronas en el que la transferencia de información sigue la ley de la polarización dinámica emitida por Cajal: a partir de las dendritas, al soma y finalmente a 34 axón. También se conocen las neuronas DA a la liberación de dopamina a partir de sus dendritas 35, generar actividad de ruptura 36 y la plasticidad 37 NMDA-receptor. la disecciónción de estos fenómenos es difícil de alcanzar sin grabaciones directas desde el lugar en que se iniciaron. Para hacerse una idea de la relación entre la ubicación exacta y las propiedades funcionales de los canales iónicos y su papel en la excitabilidad y la información de la transferencia dendríticas en las neuronas de la sustancia negra, grabaciones dendríticas directos son el método de elección.
Este informe describe un procedimiento detallado que se puede utilizar para obtener grabaciones de uno y dos patch-clamp de dendritas de las neuronas de la sustancia negra y el etiquetado de post hoc biocitina correspondiente. Los principios básicos para parchear el somática y la membrana dendríticas son muy similares. sin embargo la práctica, las grabaciones de sitios dendríticas requieren optimización específica en comparación con las grabaciones somáticas. grabaciones dendríticas exitosas dependen de la calidad de las rodajas, de ajuste óptimo de la óptica, de aproximación suave de la pipeta de parche y la estabilidad de las grabaciones.
Este informe describe un protocolo paso a paso para implementar registros de célula entera somatodendríticos duales y grabaciones dendríticas locales. Es útil para la determinación de la influencia de los canales iónicos (es decir, I H) en el curso temporal de los potenciales postsinápticos y mapeo de la distribución del canal iónico (I h) a lo largo del dominio somatodendrítica de neuronas DA nigrales, respectivamente. Resultantes mediciones electrofisiológicas se combinan para publicar histoquímica hoc para recuperar la morfología celular. Se empleó el procedimiento para investigar las neuronas DA situados en la sustancia negra, pero puede ser generalizada para las neuronas de la sustancia negra vecinos de GABA, las neuronas DA área tegmental ventral o otras neuronas del cerebro medio. Todos los pasos también pueden ser seguidos para examinar otros canales iónicos expresados en dendritas de las neuronas de la sustancia negra sin modificaciones importantes. Visualización post hoc es particularmente pertinente para las neuronas con axones de soportedendritas, como las neuronas de la sustancia negra, 25,26 interneuronas del hipocampo Oriens-alveus 21 o algunas neuronas piramidales CA1 67. Curiosamente, las neuronas que comparten esta característica parece ser más común de lo que generalmente se piensa 67. El análisis morfológico revela también la posición exacta de los electrodos y del axón. La detección de este último puede ser optimizado por el etiquetado de las proteínas expresadas en el segmento axonal inicial (canales de Na + dependientes de voltaje o Ankyrin G) mediante inmunohistoquímica 68,69.
La fiabilidad de los datos recogidos con grabaciones dendríticas y etiquetado neuronal posterior siempre depende de la calidad de la rebanada. esfuerzo máximo necesita, por tanto, que debe aplicarse para preservar la viabilidad de las células dentro del tejido. Esto se consigue con un manejo suave de los animales sanos, herramientas de alta calidad y reactivos, la oxigenación suficiente de las temperaturas del tejido y heladas durante la preparación de las rebanadas. condiciones de grabación estables dependen de la selección de las neuronas sanas. En el modo de células enteras, la resistencia serie debe inicialmente ser tan bajo como sea posible y mantenido constante durante todo el experimento. La estabilidad de las grabaciones depende más de manipuladores de alta calidad carentes de deriva y las vibraciones. Estas perturbaciones pueden ser reducidos mediante la optimización de la estabilidad de la pipeta: comprobar la conexión a soporte de pipeta y para cabezal de la platina, el control de cables que son micromanipulador holgura, evitar cambios bruscos de temperatura o movimiento de la platina y de comprobar el mecanismo del manipulador. Para grabaciones duales, metilsulfato 13,15,21 se ha incluido en la solución intracelular, pero gluconato 9,14,25 alternativamente se pueden emplear. Sin embargo, el anión principal puede alterar el potencial de membrana 70,71 y algunas corrientes dependientes de voltaje 72. solución intracelular puede ser complementado con ATP, GTP y fosfocreatina para preservar la physiologicas funciones de las neuronas. Además, la adición de un colorante fluorescente en la solución de la pipeta (por ejemplo, Alexa 594 o sulforodamina 101 41) para visualizar las dendritas durante una grabación somática puede ser útil por ejemplo para colocar una aplicación de presión (Figura 7 en la Ref. 41) o un estimulante eléctrico pipeta. La solución de la pipeta para las grabaciones adjunta células contiene una alta concentración de K + y Na + sin registrar grandes I h. Cabe destacar la relación de la concentración de Na + / K + influye en la amplitud de la corriente 10, el potencial de inversión de la corriente 11 y la compuerta de I h 73. Alternativamente, I h también se pueden grabar utilizando fuera de espera 10. En esta configuración de grabación sin embargo, el medio intracelular en la proximidad de los canales puede ser perturbado. En consecuencia, las diferencias en la activación dependiente de la tensión de I <sub> h se observa cuando se comparan las corrientes obtenidas usando parches adjunta células y fuera de espera 10. Hinchazón de las neuronas se encuentra ocasionalmente durante la grabación de patch-clamp, y, a menudo surge de causas distintas, tales como la baja calidad del agua, fuerte desequilibrio de la osmolaridad o pH entre el 39 soluciones o errores intra y extracelular en la composición de las soluciones. La calidad de los registros electrofisiológicos tiene una incidencia directa sobre la calidad de la morfología de las neuronas recuperados. Alta resistencia pipetas somáticas se utilizan para grabaciones duales (6 – 10 mO, como en Refs 6,11.) Y para las grabaciones somáticos individuales después de grabaciones adjunta células para reducir al mínimo la dilución del medio intracelular 14. Por lo tanto, la grabación somática de células enteras después de la grabación adjunta celular se mantiene corto (<10 min). parches exterior hacia fuera tanto de la somáticas y pipetas dendríticas son esenciales para el cierre correcto de la cmembrana ell y la posterior recuperación de la morfología celular. Además de la estructura de la célula, el contenido neuroquímico se puede determinar para las neuronas registradas 59,74. Por ejemplo, el intracelular tirosina hidroxilasa proteína se puede immunolabeled para la identificación inequívoca de las neuronas DA 13.
Neuronas DA se concentran principalmente en la SN pars compacta, con una densidad mucho más baja presente en el SN pars reticulata, donde se entremezclan con un mayor número de neuronas GABA 75. Mientras que el cuerpo celular de las neuronas DA es a menudo mayor que el de neuronas GABA, la identificación visual de estas células con IR-videomicroscopy es incierto y parcialmente impedido por la opacidad de los pars compacta. Para evitar estas limitaciones, la pre-selección de las neuronas DA puede ser facilitada por el uso de ratones transgénicos que expresan un marcador fluorescente en una población específica de neuronas (TH 65 o DAT para neuronas DA, GADpara las neuronas GABA) y la iluminación de epifluorescencia. Alternativamente, un colorante fluorescente puede ser incluido en la solución del electrodo somática para facilitar la visualización de las dendritas. El aumento de la resolución de la célula fluorescente es traído por hilatura Nipkow confocal de disco 14,22,30 o microscopía de dos fotones 7 combinado con IR-DGC 6. Varias ventajas están relacionadas con DGC en comparación con DIC. En primer lugar, ya que no se requieren prismas DIC, la imagen IR-DGC puede ser superpuesta con una imagen de fluorescencia 49,52,53,76. En segundo lugar, DGC se puede combinar con la fotoestimulación y optogenética 77.
Una desventaja de rebanada preparación es la preservación de la integridad de las neuronas. Neuronas DA extienden sus dendritas en los tres planos del espacio 78,79 y por lo tanto el truncamiento del compartimiento dendríticas no pueden evitarse por completo en rodajas 80. La elección de la orientación de las rebanadas (coronal, horizontal o parasagital) es un trade-off. El origen de la inervación y el diseño experimental se debe considerar para seleccionar la orientación correcta de las rebanadas.
parches dendríticas directa es la técnica utilizada para mapear la distribución de los canales iónicos funcionales en los diferentes compartimientos de las células. Además, esta técnica ofrece para determinar la variabilidad en las propiedades funcionales de los canales 20. Como complemento de la ubicación y densidad de los canales iónicos se pueden determinar mediante inmunohistoquímica en los niveles de luz y microscopía electrónica 17,23. Este enfoque también ofrece la posibilidad de determinar la densidad de canales en las estructuras de pequeño calibre que son inaccesibles para las pipetas de parche. Sin embargo, estos canales pueden estar en un estado funcional distinta 24 o incluso inactivos en comparación con los registrados utilizando técnicas de patch-clamp. Ambas técnicas son, por tanto, necesaria para obtener una imagen completa de la ubicación y las propiedades decanales iónicos en una región celular específica 17. Con el desarrollo de colorantes sensibles al voltaje, de formación de imágenes de tensión se ha utilizado para examinar la propagación de puntos de acceso y los EPSP en las neuronas en múltiples lugares 81. Como alternativa a las grabaciones de doble patch-clamp, este enfoque aún se puede implementar para dendritas finas que no son accesibles a las pipetas de parche, pero requieren una calibración precisa de la señal y el promedio.
Si bien las neuronas DA en el SN y el área tegmental ventral son ampliamente investigados a través de grabaciones somáticas en el contexto fisiológicos y fisiopatológicos, las propiedades funcionales de sus dendritas sigue siendo en gran parte desconocidos en ambas condiciones. Parches de dendritas se ha implementado para las neuronas dopaminérgicas nigrales por varios grupos con éxito 13,25,26 y sigue siendo el método de elección para diseccionar propiedades excitables de estas estructuras subcelulares finas 8. grabaciones dendríticas proporcionan una mayor opportunidad de controlar la eficiencia y la plasticidad de la transmisión sináptica y la plasticidad de la excitabilidad dendríticas 82,83.
The authors have nothing to disclose.
Doy las gracias a Dr. Vincent Seutin por su constante apoyo, Christelle Gillissen y Laurent Massotte por su excelente asistencia técnica, doctores Jean Defourny y Sandra Ormenese por los consejos con el microscopio confocal, Dr. Jacques Destiné por el don del segundo amplificador Axopatch 200B, el GIGA-Imaging plataforma para compartir el microscopio confocal y el software Imaris y el Dr. Stephen Freeman para la lectura crítica del manuscrito. Este trabajo fue apoyado por becas de los FRS belgas – FNRS (U.N002.13 y T.N0015.13) y publicado con el apoyo de la Fundación Universidad belga (Publié avec le concours de la Fundación Universitaria de Belgique).
Double-distillated water | Millipore | Super Q | Resistivity >14 MΩ cm, ideal 18.2 MΩ cm at 25°C, filtered (0.22 µm), https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Super-Q-Plus-Water-Purification-System,MM_NF-C1760 |
Microfilter candles | Robu | Porosity 3, 6 mm or 13 mm diameter | |
Tissue slicer with vibroprobe | Leica | VT1200 | cutting parameters: speed 0.07, amplitude 1.40 |
Tissue slicer | Dosaka | DTK-1000 | cutting parameters: speed 4, frequency 7 |
Razor blades | Gilette | Super Silver | |
Dissection tools | Braun, Aesculap | ||
Reserve chamber | Custom-made | ||
PP beckers | VWR | 213-1725 | 400 ml |
Syringe filter | Merk Millipore | Millex – GV 0,22 µm | |
Cyanoacrylate glue | UHU | "Sekunden Kleber" | liquid glue |
Recording chamber | Luigs & Neumann | Slice mini chamber | |
Horizontal pipette puller | Sutter Instruments | Brown-Flaming P-97 | |
Pipettes | Hilgenberg | 1807524 | 2 mm o.d./1 mm i.d. glass capilaries, ends firepolished, washed |
Dental wax | Coltène/Whaledent | orthodontic tray wax strips | |
Platinum grid | to anchor slices in the recording chamber, custom made with a platinum disk | ||
Microforge | Narishige | MF-830 | to fire-polish pipette tips |
Potassium methyl sulfate | MP Biomedicals | 215481 | |
Biocytin | Molecular probes | B1592 | |
Manometer | GREISINGER electronic | GDH 13 AN | |
Microscope | Zeiss | FS | |
Dodt Gradient Contrast | Luigs & Neumann | ||
Manipulators | Luigs & Neumann | LN Mini 25 | |
Frame grabber | The Imaging Source | DFG/USB2pro | |
Camera | DAGE-MTI | NC-70 | |
Condenser | Zeiss | high numerical aperture condenser working with oil | |
Objective | Zeiss | W Plan Apochromat 441470-9900 VIS-IR | 63x magnification, long-distance, high numerical aperture 1.0 water-immersion objective |
Fourfold-changer | Luigs & Neumann | between the camera and the microscope | |
Black & white video monitor | Sony | SSM-175CE | 16-inch, 850 TV lines, analog |
Sample Bottles, Amber Glass, with Cap | VWR | 215-2409 | to transfer slices from the setup to histology room |
The Axon Guide | Molecular Devices | Book | |
Stimfit | https://github.com/neurodroid/stimfit | Analysis of electrophysiological data | |
Paraformaldehyde | Sigma | 441244 | see SAFETY DATA SHEET and Dangerous Substances Directive (EU) before use |
Well cell culture plate | Greiner-Bio-One | 662160 | for the staining of fixed slices |
Triton X-100 | Merk | 108643 | see SAFETY DATA SHEET and Dangerous Substances Directive (EU) before use |
mouse anti-TH monoclonal primary | Immunostar | 22941 | working concentration: 1/1000 |
goat anti-mouse secondary antibody – Alexa Fluor 568 | Invitrogen – Thermo Fisher Scientific | A-11031 | working concentration: 1/500 |
Normal goat serum | Dako | X0907 | |
ProLong Diamond Antifade | Molecular Probes – Thermo Fisher Scientific | P36961 | |
Fluorescein Avidin DCS | Vector Lab | A-2011 | |
Confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
ImageJ | http://imagej.nih.gov/ij/ | ||
NeuronJ | http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/ | plugin for ImageJ | |
Imaris | http://www.bitplane.com | Reconstruction of biocytin filled neurons | |
Neuromantic | http://www.reading.ac.uk/neuromantic/ | Reconstruction of biocytin filled neurons | |
WinWCP | http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm | Analysis of electrophysiological data |