Summary

La infección experimental con<em> Listeria monocytogenes</em> Como un modelo para el estudio de host Respuestas interferón gamma

Published: November 16, 2016
doi:

Summary

Este protocolo describe cómo inocular ratones C57BL / 6J con la cepa EGD de Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) y para medir el interferón-γ (IFN-γ) las respuestas de las células asesinas naturales (NK), células T asesinas naturales (NKT), y adaptativa linfocitos T después de la infección. Este protocolo también describe cómo llevar a cabo estudios de supervivencia en ratones después de la infección con una dosis DL50 modificada del patógeno.

Abstract

L. monocytogenes es una bacteria gram-positiva que es una causa de enfermedad transmitida por alimentos en seres humanos. La infección experimental de ratones con este patógeno ha sido altamente informativo sobre el papel de las células inmunes innatas y adaptativas y citocinas específicas en la inmunidad del huésped contra los patógenos intracelulares. La producción de IFN-γ por las células innatas durante la infección subletal con L. monocytogenes es importante para la activación de los macrófagos y el control temprano del patógeno 1-3. Además, la producción de IFN-γ por los linfocitos de memoria de adaptación es importante para la imprimación de la activación de las células innatas a la reinfección 4. La L. monocytogenes modelo de infección por lo tanto sirve como una gran herramienta para investigar si las nuevas terapias que están diseñados para aumentar la producción de IFN-γ tener un impacto en las respuestas de IFN-γ in vivo y tienen efectos biológicos productivos, tales como el aumento de la eliminación de bacterias o la mejora de la supervivencia del ratón deinfección. Se describe aquí es un protocolo básico para cómo llevar a cabo las infecciones intraperitoneales de ratones C57BL / 6J con la cepa EGD de L. monocytogenes y para medir la producción de IFN-γ por las células NK, células NKT, y linfocitos de adaptación por citometría de flujo. Además, los procedimientos se describen a: (1) crecer y preparar las bacterias para la inoculación, (2) medir la carga bacteriana en el bazo y el hígado, y (3) la supervivencia medida de los animales a los puntos finales. También se proporcionan datos representativos para ilustrar cómo este modelo de infección se puede utilizar para probar el efecto de agentes específicos en las respuestas de IFN-gamma a L. monocytogenes y la supervivencia de los ratones de esta infección.

Introduction

IFN-γ es una citoquina que es crucial para la mediación de la inmunidad contra los patógenos intracelulares y para controlar el crecimiento del tumor 5. La importancia de esta citocina en la resistencia bacteriana es evidente en la observación de que los seres humanos con mutaciones en la vía de señalización de IFN-γ son altamente susceptibles a la infección por micobacterias y salmonelas 6. De manera similar, los ratones deficientes en IFN-γ o los defectos de exhibición receptor de IFN-γ en la resistencia a las micobacterias 7-9 y otros patógenos intracelulares, incluyendo L. monocytogenes 10,11, Leishmania major 12, Salmonella typhimurium 13, y ciertos virus 11. Además de los agentes patógenos que combaten, IFN-γ juega un papel crucial en la defensa de huésped contra tumores 14. Aunque una mayor producción de IFN-γ es beneficioso en el contexto de la infección o el cáncer, la producción prolongada de esta citocina se ha relacionado to el desarrollo de autoinmunidad sistémica 15-17 y la aceleración de la diabetes tipo I en el modelo de ratón diabético no obeso 18.

Las principales fuentes de IFN-γ incluyen células NK, células NKT, delta gamma células T, células T auxiliares 1 (Th1) y linfocitos T citotóxicos (CTL) 5,19,20. IFN-γ aumenta tanto la inmunidad innata y adaptativa por: (1) hasta la regulación de complejo principal de histocompatibilidad (MHC) de clase I y II expresión, (2) el aumento de la expresión de moléculas co-estimuladoras en las células presentadoras de antígeno, (3) los macrófagos mejora la fagocitosis y la producción de citoquinas pro-inflamatorias y microbicidas factores (por ejemplo, óxido nítrico y especies reactivas de oxígeno), (4) la promoción de la diferenciación de células T CD4 + vírgenes en células efectoras Th1, (5) la promoción de cambio de clase de anticuerpo a la inmunoglobulina ( Ig) 2a y IgG3 (en el ratón), (6) la inducción de la producción de quimiocinas para reclutar células inmunes a sitios de iNFECCIÓN, y (7) el aumento de células NK y las respuestas de CTL 5,19. Dada la importancia crucial de IFN-γ en la respuesta del huésped a patógenos y tumores, IFN-γ recombinante ha sido probado como tratamiento para diversas infecciones y neoplasias (revisado en 19). Sin embargo, ya que la administración sistémica de IFN-γ o la citoquina Th1 promoción de la interleucina-12 (IL-12) está asociada con efectos secundarios y la toxicidad relacionada con la dosis 19,21, existe un interés en el desarrollo de estrategias alternativas para aumentar la producción de IFN-γ por células inmunes. El desarrollo de nuevos productos biológicos y moléculas pequeñas requiere herramientas de cribado in vivo para probar si tales agentes aumentan la producción de IFN-γ durante una respuesta inmune y si esto se traduce en efectos biológicos significativos tales como el aumento en la supervivencia animal.

La infección experimental de ratones con la bacteria L. monocytogenes gram positivas ha sido un modelo Instrumental paradescifrar el papel del IFN-γ en el huésped-inmunidad contra patógenos intracelulares 1,22. La infección de ratones con el patógeno por vía intravenosa o por vía intraperitoneal (ip) conduce a la rápida difusión de las bacterias en el bazo y el hígado, donde quedan internalizadas por los macrófagos residentes y los hepatocitos con cargas bacterianas pico en el bazo se producen entre 3 y 4 días post 1,3,22 infección. La producción de IFN-γ por las células NK es importante para la activación de macrófagos y la resistencia temprana contra el patógeno 3; Sin embargo, a dosis altas infecciosas, producción de IFN-γ también puede ser perjudicial para aclaramiento patógeno 23. Células NKT son también una fuente de IFN-γ en el bazo y el hígado durante el control temprano de patógenos 2,24 y esta producción se ha demostrado para amplificar la producción de IFN-γ por otros tipos de células incluyendo las células NK 2. Por otra parte, después de acción linfocitos T de adaptación, las células T CD8 + en particular, son importantes para mediar en la eliminación del patógeno y proporcionando protección contra 1,4,22 reinfección.

Este modelo de infección ha sido atractivo para los investigadores para una serie de razones (revisado en 1). En primer lugar, la infección con el patógeno es altamente reproducible e induce una fuerte respuesta inmune Th1 y celular. En segundo lugar, durante la infección subletal, la carga bacteriana se concentra en el hígado y el bazo en los que se puede medir fácilmente. En tercer lugar, el patógeno puede ser manejado con seguridad bajo nivel de bioseguridad 2 (BSL2) condiciones. En cuarto lugar, el organismo y la respuesta inmune que genera se han caracterizado ampliamente. Por último, una variedad de cepas mutantes y genéticamente modificados han sido desarrollados que están disponibles para su uso.

Aquí se describe un protocolo básico para la inoculación de los ratones C57BL / 6J con la cepa EGD de L. monocytogenes y 25 para la medición de IFN γ rerespuestas por NK, NKT, y los linfocitos de adaptación después de la infección. También se describe cómo medir la carga bacteriana en el bazo y el hígado después de la infección subletal y para llevar a cabo estudios de supervivencia después de la infección con un LD 50 dosis modificada del patógeno. Finalmente, los datos representativos se muestran de cómo este protocolo se puede utilizar para detectar el efecto de los nuevos tratamientos en las respuestas de IFN-gamma y la supervivencia del ratón de L. monocytogenes infección.

Protocol

Notificación de seguridad Este protocolo describe la infección de ratones con L. monocytogenes en vivo. El patógeno se maneja con seguridad bajo condiciones BSL2 por personal capacitado que no están inmunocomprometidos. Las personas inmunocomprometidas son las mujeres embarazadas, los ancianos y las personas que están infectadas con el VIH o que tienen enfermedades crónicas que requieren tratamiento con la terapia inmunosupresora. El personal debe ponerse una capa protectora de …

Representative Results

La Figura 3 presenta un poco de flujo típico de citometría de tinción de IFN-γ en las células NK y NKT esplénicas a las 24 horas después de la infección con 10 5 CFU del patógeno. Esta figura también ilustra la estrategia de gating para el panel de tinción descrito en la Tabla 2. La Figura 4 muestra algunos datos representativos que se obtuvieron en un experimento donde los ratones macho se trataron con el antagonis…

Discussion

Aquí se describe un protocolo sobre cómo llevar a cabo una infección experimental básico con la cepa EGD de L. monocytogenes en 25 ratones C57BL / 6J macho o hembra. Este protocolo se creó con el fin de estudiar el efecto de una novela pequeña molécula IS001 en la producción de IFN-γ por los linfocitos innata y adaptativa in vivo 31. Mediante el control de la eliminación bacteriana y la supervivencia después de la infección, se adquirieron conocimientos sobre cómo est…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Development of this protocol was supported by an operating grant from CIHR (MOP97807) to SED.

Materials

Brain Heart Infusion Broth, Modified BD 299070 any brand should be appropriate
Agar BD 214010 any brand should be appropriate
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100 any brand should be appropriate
1xPBS Sigma D8537 any brand should be appropriate
TissueLyser II Qiagen 85300 any brand should be appropriate
Ammonium Chloride (NH3Cl) any brand should be appropriate
KHCO3 any brand should be appropriate
Na2EDTA any brand should be appropriate
RPMI 1640 Gibco 22400089 any brand should be appropriate
Fetal Bovine Serum  Gibco 12483 Before use, heat-inactivate at 56 °C for 30 min
L-glutamine Gibco 25030 any brand should be appropriate
Non-essential amino acids Gibco 11140 any brand should be appropriate
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140 any brand should be appropriate
GolgiStop Protein Transport Inhibitor (containing Monensin) BD 554724 Use 4 μl in 6 ml cell culture
16% Paraformaledehye Electron Microscopy Sciences 15710 Dilute to 4% PFA in ddH20 or 1xPBS
10 x Perm/Wash buffer BD 554723 Dilute 10x in ddH20
Fc block, Anti-Mouse CD16/CD32 Purified eBioscience 14-0161 Dilute 1:50
Fixable Viability Dye eFluor 506 eBioscience 65-0866 Dilute 1:1000 (we have also used viability dyes from Molecular Probes)
anti-Mouse CD4-PE-Cy5 (GK1.5) eBioscience 15-0041 Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
anti-Mouse CD8-FITC (53-6.7) eBioscience 11-0081 Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
PBS57/mCD1d tetramer-APC NIH Tetramer Core Facility N/A Obtained as a gift from the facility
anti-Mouse TCRβ-PE-Cy7 (H56-597) eBioscience 25-5961 Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
anti-Mouse NKp46-APC-eFluor780 (29A1.4) eBioscience 47-3351 Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
anti-Mouse CD45 PE-Cyanine7 (30-F11) eBioscience 25-0451 Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
anti-Mouse IFN gamma-PE (XMG1.2) eBioscience 12-7311 Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
OneComp eBeads eBioscience 01-1111 Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
Mouse IFN gamma ELISA kit eBioscience 88-7314 Used for measuring the interferon gamma in the culture supernatant
50 mL vented tubes for culture Used for culturing the bacteria, any brand should be appropriate
1.5 ml microcentrifuge tubes any brand should be appropriate
bacterial petri dishes any brand should be appropriate
2 ml cyrovials any brand should be appropriate
UV spectrometer any brand should be appropriate
safety engineered needles any brand should be appropriate
C57BL6/J Jackson laboratories Stock#000664 Order for arrival at 7 wks
Bleach For decontamination
70% Ethanol For decontamination
Glass beads any brand should be appropriate
Centrifuge rotor, buckets, bucket covers.
Microcentrifuge any brand should be appropriate
Sterile Glycerol any brand should be appropriate
Pipette Tips any brand should be appropriate
Pipette any brand should be appropriate
Surgical instruments any brand should be appropriate
70 micron strainers any brand should be appropriate
3 ml syringe any brand should be appropriate
Pipette gun any brand should be appropriate
Filtration Units any brand should be appropriate
Trypan Blue Dilute 1 to 9 in ddH20, any brand should be appropriate
Hemocytometer any brand should be appropriate
Round bottomed plates any brand should be appropriate
FACs tubes BD
BD LSR II BD Any flow cytometer could be used for acquisition that has an appropriate laser configuration and filter set to discriminate the fluorochormes
Flowjo software Treestar Used for data analysis. Other types of data analysis software will also be appropriate
Multichannel pipettor (0-300 µl) Eppendorf Used for washing cells and adding antibodies during flow cytometry staining
Acetic Acid Used for washing glass beads, any brand should be appropriate
Microbank Bacterial Preservation System Pro-lab Diagnositics Used as an alternative to glycerol stocks for long-term storage of bacteria

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Ahn, J. J., Selvanantham, T., Zhang, M. A., Mallevaey, T., Dunn, S. E. Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-γ Responses. J. Vis. Exp. (117), e54554, doi:10.3791/54554 (2016).

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