Summary

Infecção experimental com<em> Listeria monocytogenes</em> Como um modelo para estudar o anfitrião Respostas interferão-y

Published: November 16, 2016
doi:

Summary

Este protocolo descreve como para inocular ratinhos C57BL / 6J com a estirpe de Listeria monocytogenes EGD (L. monocytogenes) e para medir o interferão-γ (IFN-γ) respostas de células assassinas naturais (NK), as células T assassinas naturais (NKT), e adaptativa linfócitos T após a infecção. Este protocolo descreve como também a realização de estudos de sobrevivência de ratinhos após a infecção com uma dose de LD 50 modificada do agente patogénico.

Abstract

L. monocytogenes é uma bactéria Gram-positiva que é uma causa da doença de origem alimentar em humanos. A infecção experimental de ratinhos com este patogénio tem sido altamente informativos sobre o papel das células do sistema imune inata e adaptativa e citocinas específicas na imunidade do hospedeiro contra agentes patogénicos intracelulares. Produção de IFN-γ por células inatas durante a infecção com L. monocytogenes subletal é importante para a activação de macrófagos e de controlo no início do patógeno 1-3. Além disso, a produção de IFN-γ por linfócitos memória adaptativa é importante para aprontar a activação de células inatas sobre reinfecção 4. A L. monocytogenes modelo de infecção, portanto, serve como uma grande ferramenta para investigar se novas terapias que são projetados para aumentar a produção de IFN-γ ter um impacto sobre respostas de IFN-γ in vivo e têm efeitos biológicos produtivos, tais como aumento da depuração bacteriana ou melhorar a sobrevivência do mouse a partir deinfecção. Aqui descrito é um protocolo de base para a forma de realizar infecções intraperitoneais de murganhos C57BL / 6J com a estirpe de L. monocytogenes EGD e para medir a produção de IFN-γ pelas células NK, células NKT, e adaptativas linfócitos por citometria de fluxo. Além disso, os procedimentos são descritos em: (1) crescimento e preparar as bactérias para inoculação, (2) medir a carga bacteriana no baço e no fígado, e (3) medida a sobrevivência dos animais a pontos finais. Os dados representativos são também fornecidos para ilustrar a forma como este modelo de infecção pode ser utilizado para testar o efeito de agentes específicos nas respostas de IFN-gama para L. monocytogenes e sobrevivência dos ratinhos com esta infecção.

Introduction

IFN-γ é uma citocina que é crucial para mediar a imunidade contra os agentes patogénicos intracelulares e para controlar o crescimento do tumor 5. A importância desta citocina na resistência bacteriana é evidente na observação de que os seres humanos com mutações na via de sinalização de IFN-γ são altamente susceptíveis à infecção com micobactérias e salmonelas 6. De modo semelhante, os ratinhos deficientes em IFN-γ ou os defeitos exibem receptor de IFN-γ na resistência à micobactérias 7-9 e outros patogénios intracelulares, incluindo L. monocytogenes 10,11, Leishmania major 12, 13 Salmonella typhimurium, e certos vírus 11. Em adição aos agentes patogénicos que combatem, IFN-γ desempenha um papel fundamental na defesa contra hospedeiro-14 tumores. Embora uma maior produção de IFN-γ é benéfica no contexto da infecção ou cancro, a produção prolongada desta citocina tem sido associada to o desenvolvimento de auto-imunidade sistémica 15-17 e a aceleração da diabetes do tipo I no modelo de ratinho diabético não obeso 18.

As principais fontes de IFN-γ incluem células NK, células NKT, γδ células T, células T auxiliares 1 (Th1), e linfócitos T citotóxicos (CTL) 5,19,20. IFN-γ aumenta tanto a imunidade inata e adaptativa por: (1) para cima de regulação de complexo principal de histocompatibilidade (MHC) de classe I e expressão II, (2) aumento da expressão de moléculas co-estimulatórias em células que apresentam antigénios, (3) de macrófagos aumentando factores de fagocitose e a produção de citocinas pró-inflamatórias e microbicidas (por exemplo, óxido nítrico e espécies reactivas de oxigénio), (4) promover a diferenciação de células T CD4 + naive em células efectoras Th1, (5) promover a troca de classe de anticorpo para a imunoglobulina ( Ig) 2a e IgG3 (no rato), (6) indução da produção de quimiocinas para recrutar células imunes para os locais de Infection, e (7) o aumento de células NK e respostas CTL 5,19. Dada a importância crucial de IFN-γ na resposta do hospedeiro a infecções e tumores, recombinante IFN-γ foi testado como um tratamento para várias infecções e doenças malignas (revisto em 19). No entanto, porque a administração sistémica de IFN-γ ou promover a citoquina Th1 interleucina-12 (IL-12) está associada a efeitos colaterais e toxicidade relacionada com a dose 19,21, há interesse no desenvolvimento de estratégias alternativas para aumentar a produção de IFN-γ pela células do sistema imunológico. O desenvolvimento de novos produtos biológicos e moléculas pequenas requer em ferramentas de rastreio in vivo para testar se tais agentes de aumento da produção de IFN-γ durante uma resposta imune e se isto traduz-se efeitos biológicos significativos, tais como aumentos de sobrevivência do animal.

A infecção experimental de ratinhos com a bactéria L. monocytogenes gram-positiva tem sido um modelo para instrumentaldecifrar o papel do IFN-γ no hospedeiro-imunidade contra os agentes patogénicos intracelulares 1,22. Infecção de camundongos com o patógeno por via intravenosa ou por via intraperitoneal (ip) leva à rápida disseminação da bactéria para o baço e fígado, onde eles se tornam internalizadas pelos macrófagos residentes e hepatócitos com cargas bacterianas pico no baço ocorrem entre 3 e 4 dias pós- infecção 1,3,22. Produção de IFN-γ por células NK é importante para a activação de macrófagos e resistência precoce contra o agente patogénico 3; No entanto, em doses infecciosas elevados, a produção de IFN-γ também pode ser prejudicial para a depuração de agentes patogénicos 23. As células NKT são também uma fonte de IFN-γ no baço e no fígado durante o controlo de início de patógenos 2,24 e essa produção foi mostrado para amplificar a produção de IFN-γ por outros tipos de células, incluindo células NK 2. Por outro lado, mais tarde, que actuam linfócitos T adaptativos, células T CD8 + em particular, são importantes para mediar a folga do patógeno ea protecção contra 1,4,22 re-infecção.

Este modelo de infecção tem sido atraente para os investigadores para uma série de razões (revisto em 1). Em primeiro lugar, a infecção com o agente patogénico é altamente reprodutível e induz uma forte resposta imunitária Th1 e celular. Em segundo lugar, durante a infecção subletal, carga bacteriana está concentrado no fígado e baço, onde ele pode ser facilmente medido. Em terceiro lugar, o agente patogénico pode ser manuseado com segurança sob condições de segurança biológica de nível 2 (BSL2). Em quarto lugar, o organismo e a resposta imune que gera têm sido extensivamente caracterizados. Finalmente, uma variedade de estirpes mutantes e geneticamente modificadas têm sido desenvolvidos que estão disponíveis para uso.

Descrito aqui é um protocolo básico para inoculação de camundongos C57BL / 6J com a estirpe EGD de L. monocytogenes 25 e para medir IFN γ rerespos- por NK, NKT, e os linfócitos adaptativos pós-infecção. Também é descrito como para medir a carga bacteriana no baço e no fígado após a infecção subletal e para realizar estudos de sobrevivência após a infecção com uma dose de LD 50 modificada do agente patogénico. Finalmente, os dados representativos são mostrados de como este protocolo pode ser utilizado para pesquisar o efeito de novos tratamentos sobre as respostas de IFN-y e sobrevivência do ratinho de infecção por L. monocytogenes.

Protocol

Declaração de segurança Este protocolo descreve a infecção de ratinhos com L. monocytogenes vivo. O patógeno é tratado com segurança sob condições BSL2 por pessoal treinado que não estão imunocomprometidos. pessoas imunodeprimidas incluem mulheres grávidas, idosos e indivíduos que estão infectadas pelo HIV ou que tenham condições crônicas que necessitam de tratamento com terapia imunossupressora. O pessoal deve vestir um revestimento protetor laboratório ou vestido,…

Representative Results

A Figura 3 apresenta algum fluxo típico citometria de coloração de IFN-γ em células NK e NKT esplénicas às 24 h pós-infecção com 10 5 CFU de o agente patogénico. Esta figura também ilustra a estratégia de propagação para o painel de coloração descrito na Tabela 2. A Figura 4 mostra alguns dados representativos que foram obtidos numa experiência em que ratos machos foram tratados com o antagonista de PPAR? IS0…

Discussion

Descrevemos aqui um protocolo de como levar a cabo uma infecção experimental de base com a estirpe de L. monocytogenes EGD de 25 em camundongos C57BL / 6J machos ou fêmeas. Este protocolo foi criado com a finalidade de estudar o efeito de uma molécula pequena novela IS001 sobre a produção de IFN-γ por linfócitos inata e adaptativa in vivo 31. Ao monitorar depuração bacteriana e sobrevivência pós-infecção, percepções foram obtidas em como essas mudanças em IFN-γ c…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Development of this protocol was supported by an operating grant from CIHR (MOP97807) to SED.

Materials

Brain Heart Infusion Broth, Modified BD 299070 any brand should be appropriate
Agar BD 214010 any brand should be appropriate
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100 any brand should be appropriate
1xPBS Sigma D8537 any brand should be appropriate
TissueLyser II Qiagen 85300 any brand should be appropriate
Ammonium Chloride (NH3Cl) any brand should be appropriate
KHCO3 any brand should be appropriate
Na2EDTA any brand should be appropriate
RPMI 1640 Gibco 22400089 any brand should be appropriate
Fetal Bovine Serum  Gibco 12483 Before use, heat-inactivate at 56 °C for 30 min
L-glutamine Gibco 25030 any brand should be appropriate
Non-essential amino acids Gibco 11140 any brand should be appropriate
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140 any brand should be appropriate
GolgiStop Protein Transport Inhibitor (containing Monensin) BD 554724 Use 4 μl in 6 ml cell culture
16% Paraformaledehye Electron Microscopy Sciences 15710 Dilute to 4% PFA in ddH20 or 1xPBS
10 x Perm/Wash buffer BD 554723 Dilute 10x in ddH20
Fc block, Anti-Mouse CD16/CD32 Purified eBioscience 14-0161 Dilute 1:50
Fixable Viability Dye eFluor 506 eBioscience 65-0866 Dilute 1:1000 (we have also used viability dyes from Molecular Probes)
anti-Mouse CD4-PE-Cy5 (GK1.5) eBioscience 15-0041 Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
anti-Mouse CD8-FITC (53-6.7) eBioscience 11-0081 Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
PBS57/mCD1d tetramer-APC NIH Tetramer Core Facility N/A Obtained as a gift from the facility
anti-Mouse TCRβ-PE-Cy7 (H56-597) eBioscience 25-5961 Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
anti-Mouse NKp46-APC-eFluor780 (29A1.4) eBioscience 47-3351 Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
anti-Mouse CD45 PE-Cyanine7 (30-F11) eBioscience 25-0451 Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
anti-Mouse IFN gamma-PE (XMG1.2) eBioscience 12-7311 Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
OneComp eBeads eBioscience 01-1111 Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
Mouse IFN gamma ELISA kit eBioscience 88-7314 Used for measuring the interferon gamma in the culture supernatant
50 mL vented tubes for culture Used for culturing the bacteria, any brand should be appropriate
1.5 ml microcentrifuge tubes any brand should be appropriate
bacterial petri dishes any brand should be appropriate
2 ml cyrovials any brand should be appropriate
UV spectrometer any brand should be appropriate
safety engineered needles any brand should be appropriate
C57BL6/J Jackson laboratories Stock#000664 Order for arrival at 7 wks
Bleach For decontamination
70% Ethanol For decontamination
Glass beads any brand should be appropriate
Centrifuge rotor, buckets, bucket covers.
Microcentrifuge any brand should be appropriate
Sterile Glycerol any brand should be appropriate
Pipette Tips any brand should be appropriate
Pipette any brand should be appropriate
Surgical instruments any brand should be appropriate
70 micron strainers any brand should be appropriate
3 ml syringe any brand should be appropriate
Pipette gun any brand should be appropriate
Filtration Units any brand should be appropriate
Trypan Blue Dilute 1 to 9 in ddH20, any brand should be appropriate
Hemocytometer any brand should be appropriate
Round bottomed plates any brand should be appropriate
FACs tubes BD
BD LSR II BD Any flow cytometer could be used for acquisition that has an appropriate laser configuration and filter set to discriminate the fluorochormes
Flowjo software Treestar Used for data analysis. Other types of data analysis software will also be appropriate
Multichannel pipettor (0-300 µl) Eppendorf Used for washing cells and adding antibodies during flow cytometry staining
Acetic Acid Used for washing glass beads, any brand should be appropriate
Microbank Bacterial Preservation System Pro-lab Diagnositics Used as an alternative to glycerol stocks for long-term storage of bacteria

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Ahn, J. J., Selvanantham, T., Zhang, M. A., Mallevaey, T., Dunn, S. E. Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-γ Responses. J. Vis. Exp. (117), e54554, doi:10.3791/54554 (2016).

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