Summary

العدوى التجريبية مع<em> المستوحدة الليستيريا</em> نموذجا لدراسة المضيف الردود انترفيرون γ

Published: November 16, 2016
doi:

Summary

يصف هذا البروتوكول كيفية تطعيم C57BL / 6J الفئران بسلالة EGD من المستوحدة الليستيريا (اللستيريا L.) وقياس الإنترفيرون γ (IFN-γ) ردود القاتلة الطبيعية (NK) الخلايا، القاتلة الطبيعية الخلايا التائية (NKT)، والتكيف الخلايا اللمفية تي بعد الإصابة. يصف هذا البروتوكول أيضا كيفية إجراء دراسات البقاء على قيد الحياة في الفئران بعد الإصابة مع تعديل LD 50 جرعة من العوامل المسببة للأمراض.

Abstract

اللستيريا L. هي نوع من البكتيريا إيجابية الجرام التي هي سبب الأمراض التي تنقلها الأغذية في البشر. وكانت العدوى التجريبية من الفئران مع هذا الممرض بالمعلومات كبير على دور الخلايا المناعية الفطرية والتكيفية والسيتوكينات محددة في الحصانة المضيف ضد مسببات الأمراض داخل الخلايا. إنتاج الإنترفيرون γ الخلايا الفطرية خلال العدوى دون المميت مع المستوحدة L. مهم لتفعيل الضامة والمكافحة المبكرة من مسببات المرض 1-3. وبالإضافة إلى ذلك، إنتاج الإنترفيرون γ بواسطة الخلايا الليمفاوية الذاكرة التكيف مهم لفتيلة تنشيط الخلايا الفطرية على الإصابة مرة أخرى 4. وL. المستوحدة نموذج العدوى بالتالي بمثابة أداة عظيمة للتحقيق في ما إذا كانت العلاجات الجديدة التي تهدف إلى زيادة إنتاج الإنترفيرون γ لها تأثير على ردود الإنترفيرون جاما في الجسم الحي ولها آثار بيولوجية الإنتاجية مثل زيادة إزالة البكتيريا أو تحسين البقاء على قيد الحياة الماوس من عندعدوى. وصفت هنا هو بروتوكول الأساسي لكيفية إجراء التهابات في الغشاء البريتوني من C57BL / 6J الفئران بسلالة EGD من المستوحدة L. ولقياس إنتاج الإنترفيرون γ بواسطة الخلايا القاتلة الطبيعية، والخلايا NKT، والخلايا الليمفاوية التكيف التدفق الخلوي. وبالإضافة إلى ذلك، وصفت الإجراءات ما يلي: (1) النمو وتعد البكتيريا للتلقيح، (2) قياس الحمولة الجرثومية في الطحال والكبد، و (3) بقاء التدبير الحيوان إلى النهاية. يتم توفير بيانات تمثيلية أيضا لتوضيح كيفية هذا النموذج العدوى يمكن استخدامها لاختبار تأثير عوامل معينة على الردود IFN-γ إلى المستوحدة L. وبقاء الفئران من هذه العدوى.

Introduction

IFN-γ هو خلوى أن أمر حاسم للوساطة مناعة ضد مسببات الأمراض داخل الخلايا والسيطرة على نمو الورم 5. أهمية هذا خلوى في مقاومة البكتيريا هو واضح في الملاحظة بأن البشر مع طفرات في إشارة مسار IFN-γ هي عرضة للإصابة مع المتفطرات وsalmonellae 6. وبالمثل، الفئران التي تعاني من نقص في أي من الإنترفيرون γ أو العيوب مستقبلات المعرض الإنترفيرون جاما في مقاومة المتفطرات 7-9 وغيرها من مسببات الأمراض داخل الخلايا بما في ذلك L. المستوحدة 10،11، الليشمانيا الرئيسي 12، السالمونيلا التيفية الفأرية 13، وبعض الفيروسات 11. بالإضافة إلى مسببات الأمراض مكافحة، يلعب IFN-γ دورا حاسما في الدفاع المضيف ضد الأورام 14. على الرغم من ارتفاع إنتاج الإنترفيرون γ هو مفيد في سياق العدوى أو السرطان، والإنتاج لفترات طويلة من هذا خلوى ارتبط رس تطوير مناعة ذاتية جهازية 15-17 وتسارع من نوع الأول من مرض السكري في غير البدناء نموذج الفأر السكري 18.

وتشمل المصادر الرئيسية للIFN-γ الخلايا القاتلة الطبيعية، والخلايا NKT، γδ خلايا T، المساعد 1 خلايا T (TH1)، والخلايا الليمفاوية التائية السامة (CTL) 5،19،20. IFN-γ يعزز كلا المناعة الفطرية والتكيفية من (1)، حتى تنظيم التوافق النسيجي الرئيسي المعقدة (MHC) من الدرجة الأولى والثانية التعبير، (2) زيادة التعبير عن جزيئات شارك في تنشيطية على خلايا مقدمة للمستضد، (3) تعزيز البلاعم العوامل البلعمة وإنتاج السيتوكينات الموالية للالتهابات وميكروبات (على سبيل المثال، وأكسيد النيتريك وأنواع الاكسجين التفاعلية)، (4) تعزيز تمايز الخلايا CD4 + T ساذجة إلى خلايا المستجيب TH1، (5) تشجيع التحول من الدرجة الأجسام المضادة للالمناعي ( IG) 2A و IgG3 (في الماوس)، (6) يحفز إنتاج كيموكينات لتجنيد الخلايا المناعية لمواقع طnfection، و (7) تعزيز الخلايا القاتلة الطبيعية وردود CTL 5،19. نظرا للأهمية الحاسمة من الإنترفيرون γ في استجابة المضيف لمسببات الأمراض والأورام، وقد تم اختبار المؤتلف الإنترفيرون γ كعلاج لمختلف الأمراض والأورام الخبيثة (التي استعرضت في 19). ومع ذلك، لأن إدارة النظامية من الإنترفيرون γ أو TH1 تعزيز خلوى انترلوكين 12 (IL-12) ويرتبط مع الآثار الجانبية والسمية 19،21 المتعلقة جرعة، هناك مصلحة في وضع استراتيجيات بديلة لزيادة إنتاج الإنترفيرون جاما من قبل الخلايا المناعية. تطوير البيولوجية الجديدة والجزيئات الصغيرة تتطلب في أدوات فيفو فحص لاختبار ما إذا كان هذه العوامل زيادة إنتاج الإنترفيرون γ خلال الاستجابة المناعية وإذا كان هذا يترجم إلى تأثيرات بيولوجية ذات مغزى مثل الزيادات في البقاء على قيد الحياة الحيوانية.

وكانت العدوى التجريبية من الفئران مع بكتيريا اللستيريا L. إيجابية الجرام نموذج فعال لفك رموز دور الإنترفيرون γ في المضيف مناعة ضد مسببات الأمراض داخل الخلايا 1،22. إصابة الفئران مع الممرض عن طريق الوريد أو داخل الصفاق (IP) يؤدي إلى الانتشار السريع للبكتيريا إلى الطحال والكبد، حيث تصبح داخليا من قبل الضامة المقيمة وخلايا الكبد مع الحمل البكتيري الذروة في الطحال التي تحدث بين 3 و 4 أيام مرحلة ما بعد عدوى 1،3،22. إنتاج الإنترفيرون γ بواسطة الخلايا القاتلة الطبيعية مهم لتنشيط البلاعم والمقاومة الأولى ضد الممرض ولكن في جرعات المعدية العالية، وإنتاج الإنترفيرون γ يمكن أيضا أن يكون ضارا لإزالة مسببات المرض 23. خلايا NKT هي أيضا مصدر من الإنترفيرون γ في الطحال والكبد أثناء المكافحة المبكرة من مسببات الأمراض 2،24 ولقد ثبت هذا الإنتاج لتضخيم إنتاج الإنترفيرون γ من أنواع الخلايا الأخرى بما في ذلك الخلايا القاتلة الطبيعية (2). من ناحية أخرى، في وقت لاحق المفعول الخلايا اللمفية تي التكيف، وخلايا CD8 + T في حزبدائرية، هي مهمة للوساطة في تخليص الممرض وتوفير الحماية ضد 1،4،22 إعادة العدوى.

وكان هذا النموذج العدوى جذابة للباحثين لعدد من الأسباب (التي استعرضت في 1). أولا، والعدوى مع الممرض هو تكرار للغاية ويؤدي الى استجابة مناعية قوية Th1 و الخلوية. ثانيا، خلال العدوى دون المميت، يتركز الحمل البكتيري في الكبد والطحال حيث يمكن قياسه بسهولة. ثالثا، الممرض يمكن التعامل معها بأمان تحت السلامة الأحيائية المستوى 2 (BSL2) الظروف. رابعا، إن الكائن الحي والاستجابة المناعية أنه يولد اتسمت على نطاق واسع. وأخيرا، وضعت مجموعة متنوعة من سلالات متحولة والمعدلة وراثيا التي تتوفر للاستخدام.

وصفت هنا هو بروتوكول الأساسي للتلقيح C57BL / 6J الفئران بسلالة EGD من L. اللستيريا 25 ولقياس IFN γ إعادةردود الأفعال التي كتبها NK، NKT، والخلايا الليمفاوية على التكيف في مرحلة ما بعد الإصابة. كما وصفت هو كيفية قياس الحمولة الجرثومية في الطحال والكبد بعد الإصابة دون المميت وإجراء دراسات البقاء على قيد الحياة بعد الإصابة مع تعديل LD 50 جرعة من العوامل المسببة للأمراض. وأخيرا، أظهرت بيانات تمثيلية لكيفية هذا البروتوكول يمكن استخدامها لفحص تأثير علاجات جديدة على الردود IFN-γ والبقاء على قيد الحياة الماوس من L. المستوحدة العدوى.

Protocol

بيان السلامة يصف هذا البروتوكول إصابة الفئران مع المستوحدة L. الحية. تتم معالجة العوامل المسببة للأمراض بأمان في ظل ظروف BSL2 من قبل أفراد مدربين الذين لا يعانون من نقص المناعة. تشمل الأشخاص القليلي المناعة النساء الحوامل وكبار…

Representative Results

ويعرض الشكل 3 بعض تدفق نموذجي الخلوي تلطيخ IFN-γ في الخلايا القاتلة الطبيعية وNKT الطحال في 24 ساعة بعد العدوى مع 10 5 كفو من مسببات المرض. كما يوضح هذا الرقم استراتيجية النابضة لوحة تلطيخ هو موضح في الجدول رقم (2). ويبين الشكل 4</s…

Discussion

نحن هنا وصف بروتوكول لكيفية إجراء العدوى التجريبية الأساسية مع سلالة EGD من L. اللستيريا 25 في الذكور أو الإناث C57BL / 6J الفئران. تم تعيين هذا البروتوكول لهذا الغرض من دراسة تأثير رواية IS001 جزيء صغير على إنتاج الإنترفيرون γ بواسطة الخلايا الليمفاوية الفطرية وال?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Development of this protocol was supported by an operating grant from CIHR (MOP97807) to SED.

Materials

Brain Heart Infusion Broth, Modified BD 299070 any brand should be appropriate
Agar BD 214010 any brand should be appropriate
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100 any brand should be appropriate
1xPBS Sigma D8537 any brand should be appropriate
TissueLyser II Qiagen 85300 any brand should be appropriate
Ammonium Chloride (NH3Cl) any brand should be appropriate
KHCO3 any brand should be appropriate
Na2EDTA any brand should be appropriate
RPMI 1640 Gibco 22400089 any brand should be appropriate
Fetal Bovine Serum  Gibco 12483 Before use, heat-inactivate at 56 °C for 30 min
L-glutamine Gibco 25030 any brand should be appropriate
Non-essential amino acids Gibco 11140 any brand should be appropriate
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140 any brand should be appropriate
GolgiStop Protein Transport Inhibitor (containing Monensin) BD 554724 Use 4 μl in 6 ml cell culture
16% Paraformaledehye Electron Microscopy Sciences 15710 Dilute to 4% PFA in ddH20 or 1xPBS
10 x Perm/Wash buffer BD 554723 Dilute 10x in ddH20
Fc block, Anti-Mouse CD16/CD32 Purified eBioscience 14-0161 Dilute 1:50
Fixable Viability Dye eFluor 506 eBioscience 65-0866 Dilute 1:1000 (we have also used viability dyes from Molecular Probes)
anti-Mouse CD4-PE-Cy5 (GK1.5) eBioscience 15-0041 Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
anti-Mouse CD8-FITC (53-6.7) eBioscience 11-0081 Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
PBS57/mCD1d tetramer-APC NIH Tetramer Core Facility N/A Obtained as a gift from the facility
anti-Mouse TCRβ-PE-Cy7 (H56-597) eBioscience 25-5961 Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
anti-Mouse NKp46-APC-eFluor780 (29A1.4) eBioscience 47-3351 Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
anti-Mouse CD45 PE-Cyanine7 (30-F11) eBioscience 25-0451 Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
anti-Mouse IFN gamma-PE (XMG1.2) eBioscience 12-7311 Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
OneComp eBeads eBioscience 01-1111 Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use.
Mouse IFN gamma ELISA kit eBioscience 88-7314 Used for measuring the interferon gamma in the culture supernatant
50 mL vented tubes for culture Used for culturing the bacteria, any brand should be appropriate
1.5 ml microcentrifuge tubes any brand should be appropriate
bacterial petri dishes any brand should be appropriate
2 ml cyrovials any brand should be appropriate
UV spectrometer any brand should be appropriate
safety engineered needles any brand should be appropriate
C57BL6/J Jackson laboratories Stock#000664 Order for arrival at 7 wks
Bleach For decontamination
70% Ethanol For decontamination
Glass beads any brand should be appropriate
Centrifuge rotor, buckets, bucket covers.
Microcentrifuge any brand should be appropriate
Sterile Glycerol any brand should be appropriate
Pipette Tips any brand should be appropriate
Pipette any brand should be appropriate
Surgical instruments any brand should be appropriate
70 micron strainers any brand should be appropriate
3 ml syringe any brand should be appropriate
Pipette gun any brand should be appropriate
Filtration Units any brand should be appropriate
Trypan Blue Dilute 1 to 9 in ddH20, any brand should be appropriate
Hemocytometer any brand should be appropriate
Round bottomed plates any brand should be appropriate
FACs tubes BD
BD LSR II BD Any flow cytometer could be used for acquisition that has an appropriate laser configuration and filter set to discriminate the fluorochormes
Flowjo software Treestar Used for data analysis. Other types of data analysis software will also be appropriate
Multichannel pipettor (0-300 µl) Eppendorf Used for washing cells and adding antibodies during flow cytometry staining
Acetic Acid Used for washing glass beads, any brand should be appropriate
Microbank Bacterial Preservation System Pro-lab Diagnositics Used as an alternative to glycerol stocks for long-term storage of bacteria

References

  1. Pamer, E. G. Immune responses to Listeria monocytogenes. Nat Rev Immunol. 4 (10), 812-823 (2004).
  2. Ranson, T., et al. Invariant V alpha 14+ NKT cells participate in the early response to enteric Listeria monocytogenes infection. J Immunol. 175 (2), 1137-1144 (2005).
  3. Bancroft, G. J., Schreiber, R. D., Unanue, E. R. Natural immunity: a T-cell-independent pathway of macrophage activation, defined in the scid mouse. Immunol Rev. 124, 5-24 (1991).
  4. Soudja, S. M., et al. Memory-T-cell-derived interferon-gamma instructs potent innate cell activation for protective immunity. Immunity. 40 (6), 974-988 (2014).
  5. Schoenborn, J. R., Wilson, C. B. Regulation of interferon-gamma during innate and adaptive immune responses. Adv Immunol. 96, 41-101 (2007).
  6. Filipe-Santos, O., et al. Inborn errors of IL-12/23- and IFN-gamma-mediated immunity: molecular, cellular, and clinical features. Semin Immunol. 18 (6), 347-361 (2006).
  7. Flynn, J. L., et al. An essential role for interferon gamma in resistance to Mycobacterium tuberculosis infection. J Exp Med. 178 (6), 2249-2254 (1993).
  8. Cooper, A. M., et al. Disseminated tuberculosis in interferon gamma gene-disrupted mice. J Exp Med. 178 (6), 2243-2247 (1993).
  9. Dalton, D. K., et al. Multiple defects of immune cell function in mice with disrupted interferon-gamma genes. Science. 259 (5102), 1739-1742 (1993).
  10. Harty, J. T., Bevan, M. J. Specific immunity to Listeria monocytogenes in the absence of IFN gamma. Immunity. 3 (1), 109-117 (1995).
  11. Huang, S., et al. Immune response in mice that lack the interferon-gamma receptor. Science. 259 (5102), 1742-1745 (1993).
  12. Wang, Z. E., Reiner, S. L., Zheng, S., Dalton, D. K., Locksley, R. M. CD4+ effector cells default to the Th2 pathway in interferon gamma-deficient mice infected with Leishmania major. J Exp Med. 179 (4), 1367-1371 (1994).
  13. Hess, J., Ladel, C., Miko, D., Kaufmann, S. H. Salmonella typhimurium aroA- infection in gene-targeted immunodeficient mice: major role of CD4+ TCR-alpha beta cells and IFN-gamma in bacterial clearance independent of intracellular location. J Immunol. 156 (9), 3321-3326 (1996).
  14. Ikeda, H., Old, L. J., Schreiber, R. D. The roles of IFN gamma in protection against tumor development and cancer immunoediting. Cytokine Growth Factor Rev. 13 (2), 95-109 (2002).
  15. Hodge, D. L., et al. IFN-gamma AU-rich element removal promotes chronic IFN-gamma expression and autoimmunity in mice. J Autoimmun. 53, 33-45 (2014).
  16. Seery, J. P., Carroll, J. M., Cattell, V., Watt, F. M. Antinuclear autoantibodies and lupus nephritis in transgenic mice expressing interferon gamma in the epidermis. J Exp Med. 186 (9), 1451-1459 (1997).
  17. Peng, S. L., Moslehi, J., Craft, J. Roles of interferon-gamma and interleukin-4 in murine lupus. J Clin Invest. 99 (8), 1936-1946 (1997).
  18. Savinov, A. Y., Wong, F. S., Chervonsky, A. V. IFN-gamma affects homing of diabetogenic T cells. J Immunol. 167 (11), 6637-6643 (2001).
  19. Miller, C. H., Maher, S. G., Young, H. A. Clinical Use of Interferon-gamma. Ann N Y Acad Sci. 1182, 69-79 (2009).
  20. Paget, C., Chow, M. T., Duret, H., Mattarollo, S. R., Smyth, M. J. Role of gammadelta T cells in alpha-galactosylceramide-mediated immunity. J Immunol. 188 (8), 3928-3939 (2012).
  21. Leonard, J. P., et al. Effects of single-dose interleukin-12 exposure on interleukin-12-associated toxicity and interferon-gamma production. Blood. 90 (7), 2541-2548 (1997).
  22. Zenewicz, L. A., Shen, H. Innate and adaptive immune responses to Listeria monocytogenes: a short overview. Microbes Infect. 9 (10), 1208-1215 (2007).
  23. Viegas, N., et al. IFN-gamma production by CD27(+) NK cells exacerbates Listeria monocytogenes infection in mice by inhibiting granulocyte mobilization. Eur J Immunol. 43 (10), 2626-2637 (2013).
  24. Selvanantham, T., et al. Nod1 and Nod2 enhance TLR-mediated invariant NKT cell activation during bacterial infection. J Immunol. 191 (11), 5646-5654 (2013).
  25. Becavin, C., et al. Comparison of widely used Listeria monocytogenes strains EGD, 10403S, and EGD-e highlights genomic variations underlying differences in pathogenicity. MBio. 5 (2), e00969-e00914 (2014).
  26. Jones, G. S., D’Orazio, S. E. F. Unit 9B.2 Listeria monocytogenes: cultivation and laboratory maintenance, Chapter 31B. Curr Protoc Microbiol. , (2013).
  27. Conour, L. A., Murray, K. A., Brown, M. J. Preparation of animals for research–issues to consider for rodents and rabbits. ILAR J. 47 (4), 283-293 (2006).
  28. Obernier, J. A., Baldwin, R. L. Establishing an appropriate period of acclimatization following transportation of laboratory animals. ILAR J. 47 (4), 364-369 (2006).
  29. Zhang, M. A., Ahn, J. J., Zhao, F. L., Selvanantham, T., Mallevaey, T., Stock, N., Correa, L., Clark, R., Spaner, D., Dunn, S. E. Antagonizing peroxisome proliferator-activated receptor alpha (PPARalpha) activity enhances Th1 immunity in male mice. J. Immunol. , (2015).
  30. Kaplan, E. L., Meier, P. Nonparametric estimation from incomplete observations. J Amer Stat Assoc. 53, 457-481 (1958).
  31. Brown, D. R., et al. Limited role of CD28-mediated signals in T helper subset differentiation. J Exp Med. 184 (3), 803-810 (1996).
  32. Czuprynski, C. J., Brown, J. F. The relative difference in anti-Listeria resistance of C57BL/6 and A/J mice is not eliminated by active immunization or by transfer of Listeria-immune T cells. Immunology. 58 (3), 437-443 (1986).
  33. Busch, D. H., Vijh, S., Pamer, E. G. Animal model for infection with Listeria monocytogenes, Chapter 19. Curr Protoc Immunol. , (2001).
  34. Mekada, K., et al. Genetic differences among C57BL/6 substrains. Exp Anim. 58 (2), 141-149 (2009).
  35. Ivanov, I. I., et al. Specific microbiota direct the differentiation of IL-17-producing T-helper cells in the mucosa of the small intestine. Cell Host Microbe. 4 (4), 337-349 (2008).
  36. Bou Ghanem, N. E., Myers-Morales, T., Jones, G. S., D’Orazio, S. E. Oral transmission of Listeria monocytogenes in mice via ingestion of contaminated food. J Vis Exp. (75), e50381 (2013).
  37. Lecuit, M., Dramsi, S., Gottardi, C., Fedor-Chaiken, M., Gumbiner, B., Cossart, P. A single amino acid in E-cadherin responsible for host specificity towards the human pathogen Listeria monocytogenes. Embo J. 18 (14), 3956-3963 (1999).
  38. Wollert, T., et al. Extending the host range of Listeria monocytogenes by rational protein design. Cell. 129 (5), 891-902 (2007).
  39. Brunt, L. M., Portnoy, D. A., Unanue, E. R. Presentation of Listeria monocytogenes to CD8+ T cells requires secretion of hemolysin and intracellular bacterial growth. J Immunol. 145 (11), 3540-3546 (1990).
  40. Muraille, E., et al. Distinct in vivo dendritic cell activation by live versus killed Listeria monocytogenes. Eur J Immunol. 35 (5), 1463-1471 (2005).
  41. Datta, S. K., et al. Vaccination with irradiated Listeria induces protective T cell immunity. Immunity. 25 (1), 143-152 (2006).
  42. Geginat, G., Schenk, S., Skoberne, M., Goebel, W., Hof, H. A novel approach of direct ex vivo epitope mapping identifies dominant and subdominant CD4 and CD8 T cell epitopes from Listeria monocytogenes. J Immunol. 166 (3), 1877-1884 (2001).
  43. Shen, H., et al. Recombinant Listeria monocytogenes as a live vaccine vehicle for the induction of protective anti-viral cell-mediated immunity. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (9), 3987-3991 (1995).
  44. Foulds, K. E., et al. Cutting edge: CD4 and CD8 T cells are intrinsically different in their proliferative responses. J Immunol. 168 (4), 1528-1532 (2002).

Play Video

Cite This Article
Ahn, J. J., Selvanantham, T., Zhang, M. A., Mallevaey, T., Dunn, S. E. Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-γ Responses. J. Vis. Exp. (117), e54554, doi:10.3791/54554 (2016).

View Video