Summary

EAK 16-II / EAKIIH6自己組織化ヒドロゲルとFACS精製した胸腺上皮細胞の3-D集約を推進

Published: June 27, 2016
doi:

Summary

This video demonstrates a protocol to enrich thymic epithelial cells (TECs) with density gradient for FACS isolation. It also shows the use of EAK16-II/EAKIIH6 peptides to promote the TEC aggregate formation. The microenvironments of EAK16-II/EAKIIH6 hydrogel provide the 3-D configuration necessary to maintain the survival and function of the TECs.

Abstract

Thymus involution, associated with aging or pathological insults, results in diminished output of mature T-cells. Restoring the function of a failing thymus is crucial to maintain effective T cell-mediated acquired immune response against invading pathogens. However, thymus regeneration and revitalization proved to be challenging, largely due to the difficulties of reproducing the unique 3D microenvironment of the thymic stroma that is critical for the survival and function of thymic epithelial cells (TECs). We developed a novel hydrogel system to promote the formation of TEC aggregates, based on the self-assembling property of the amphiphilic EAK16-II oligopeptides and its histidinylated analogue EAKIIH6. TECs were enriched from isolated thymic cells with density-gradient, sorted with fluorescence-activated cell sorting (FACS), and labeled with anti-epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) antibodies that were anchored, together with anti-His IgGs, on the protein A/G adaptor complexes. Formation of cell aggregates was promoted by incubating TECs with EAKIIH6 and EAK16-II oligopeptides, and then by increasing the ionic concentration of the medium to initiate gelation. TEC aggregates embedded in EAK hydrogel can effectively promote the development of functional T cells in vivo when transplanted into the athymic nude mice.

Introduction

胸腺は、獲得免疫系の機能に必須である病原体反応、自己寛容T細胞の多様な集団の生成を担う主要なリンパ器官です。それは、胸腺細胞の開発、リンパ球前駆細胞として骨髄から移住動的な器官である、胸腺間質のスポンジ状の三次元(3-D)マトリックスを通って移動し、系統仕様と分化を起こし、最終的にのように移住します成熟T細胞。このよくプログラムされたプロセスの成功は、移行胸腺細胞や住宅胸腺上皮細胞(TECを)、胸腺微小環境の整合性を確立し、維持するために必須である胸腺間質の優勢な集団間のクロストークに大きく依存します。

その解剖学的位置とユニークな機能に基づいて、TECのは、2つのサブセットに分けることができます。皮質でのTEC responある(cTECs)1,2- T細胞(正の選択)を制限し、自己MHC(主要組織適合遺伝子複合体)を選択するためのsible、および自己反応性T細胞を除去するために不可欠である髄質(mTECs)中のTEC(負の選択)。多くの要因( 例えば 、老化、感染症、放射線照射、薬物治療)は妥協適応免疫が得られ、胸腺上皮に不可逆的な損傷を引き起こす可能性があります。多くの試みにもかかわらず、胸腺機能を回復することは、胸腺微小環境を再現する難しさに挑戦してきました。 2次元環境で培養のTECが急激胸腺形成3,4のための重要な遺伝子の発現を減少させる一方、特に、胸腺三次元(3-D)の構成は、のTECの生存および機能に重要です。

EAK16-II(AEAEKAKAEAEAKAK)およびそのC末端histidinylatedアナログEAKIIH6(AEAEKAKAEAEAKAKHHHHHH)は低分子量であり、脱イオンWATEに可溶性である両親媒性オリゴペプチドRが、20mMのNaClを(ヒト体液中の正常な塩濃度は、154 mMで)より高いイオン強度に曝されたとき、β原線維を形成するためにゲル化を受けます。この環境応答性は、3D構造を形成するように多目的なビルディングブロックを作ります。複合タンパク質薬物および他の生体分子を固定するためのアダプタとして機能することができる(:EAKII-H6上のHisタグは、ドッキング機構を、これにより抗HisのIgG / Fc結合組換えタンパク質A / G(PA / GはαH6)提供します例えばヒドロゲル複合5-8に、抗体)。

我々は以前に、ヒドロゲルに固定蛍光標識されたIgG分子は、最大13日間9のための注入部位に保持することができることを実証しました。 αH6時更に、抗CD4 IgGを用いて固定PA / GアダプタがEAK16-II / EAKIIH6(EAK)ヒドロゲルに添加し、CD4 + T細胞を特異的に10を捕捉しました。同様の技術を使用して、我々は最近のTEC Cの3-Dの凝集を実証しています(:PA / G:αEpCAMαH6)TEC-特定の抗EpCAM抗体を運ぶアダプター複合体とEAKハイドロゲルに昇格するウルド。ヌードマウスの腎臓カプセル下に移植した場合、EAKハイドロゲルに埋め込 ​​まれたTECクラスタが効果的に生体内11,12機能的なT細胞の開発を支援することができます。

ここでは、迅速かつ効果的に蛍光活性化細胞選別(FACS)でのTECを浄化し、EAKハイドロゲルシステムと3次元TEC凝集体を生成するために、我々の方法を示します。

Protocol

実験で使用した全ての動物は、アレゲニー健康ネットワーク/アレゲニーシンガー研究所の施設内動物管理使用委員会によって審査および承認されたプロトコルの下でアレゲニー・シンガー研究所の動物施設に収容しました。 1.コラゲナーゼで胸腺を消化収穫胸腺。 胸腺を収穫するために、二酸化炭素(CO 2)チャンバー内で3-5週齢のC57BL6 / Jマウス?…

Representative Results

CD45-間質細胞を濃縮するために密度勾配分離プロトコルを使用しての有効性を調べるために、インタフェースと沈殿リンパ球ペレットの両方から採取した細胞を、抗CD45及び抗EpCAM抗体で染色しました。抗ULEX Europaeusアグルチニン1(UEA1)および抗MHCクラスII抗体の両方がさらにCTECとMTECサブセットを識別するために、染色カクテルに含まれていました。 図1?…

Discussion

TECは、胸腺間質の優勢な集団であると胸腺の構造と機能のために重要な役割を果たしているが、それらは、総胸腺細胞充実の約0.1から0.5パーセントを表します。彼らはまた、細胞死の高いパーセンテージは時折すなわち 、治療は、細胞外マトリックス(ECM)からのTECを解離するために、コラゲナーゼ消化後に観察されている脆弱な細胞です。その希少性(マウス胸腺あたり200,000)お?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作品は、国立衛生研究所によって部分的にサポートされていたR21 AI113000(WSM)とR01 AI123392(YF)を付与します。

Materials

1. TEC Isolation
70% Ethanol Decon Laboratories 2701(1 Gallon) Ethanol 200 Proof, deionized water
Dissecting scissors, straight Fine Science Tools, Inc. 91460-11
Graefe forceps, straight Fine Science Tools, Inc. 11053-10
Graefe forceps, curved Fine Science Tools, Inc. 11052-10
Washing solution 1X PBS, 0.1% BSA, 2mM EDTA
1x PBS (Phosphate buffered saline) Gibco 10010-023
BSA (Bovine serum albumin) Sigma A1470-100G
EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) Invitrogen 15575-038
Digestion solution 9 mL RPMI-1640, 0.025 mg/mL Liberase TM Research grade, 10 mM HEPES, 0.2 mg/mL DNaseI
RPMI-1640 Gibco 11879-020
Liberase TM Research Grade Roche 05 401 127 001 referred as "purified collagenase"
1M HEPES Lonza 17-737E
Dnase I Roche 10 104 159 001
50mL Centrifuge tube Corning 430290
60mm tissue culture dish Falcon 353002
1/2cc U-100 Insulin syringe 28G1/2 Becton Dickinson 329461
5mL Polystyrene round-bottom tube Falcon 352058
5ml glass pipet Fisher Healthcare 13-678-27E Use for rinsing the thymic fragments. Thymic fragments tend to stick to the wall with plastic pipets.
MACSmix tube rotator Miltenyi 130-090-753
100um Cell strainer Falcon 352360
Density gradient medium: OptiPrep Axis-Shield
Name Company Catalog Number Comments
2. Cell sorting
5mL Polypropylene round-bottom tube Falcon 352063
Anti-mouse CD16/CD32 (Fc Block) BD Biosciences 553142 Use as undiluted, 2uL per sample
Anti-mouse CD45-PercpCy5.5 eBioscience 45-0451-80 Use at 1:150, 10uL per sample
Anti-mouse CD326 (EpCAM)-PE eBioscience 12-5791-82 Use at 1:100, 10uL per sample
BD Influx BD Biosciences
Single cell analysis software FlowJo
Name Company Catalog Number Comments
2. EAK gel assembly
Anti-His-Tag AnaSpec 29673 "anti-His-Tag IgG"
Purified anti-mouse CD326 (EpCAM) BioLegend 118202 "anti-EpCAM IgG"
Recombinant protein A/G Pierce Biotechnology
1.5mL Safe-Lock Tubes, Biopur, Sterile Fisher Healthcare 05-402-24B referred as "1.5mL microcentrifuge tube" 
96-well, Tissue culture plate, Round-bottom with low evaporation lid BD Falcon 353917
Rocking platform: Nutator Mixer no.1105 BD Clay Adams
10% sucrose Sigma S0389 Prepare with sterile distilled water
EAK16-II (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAK-CONH2) American Peptide Company  custom synthesized, 10mg/mL
EAKIIH6 (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAKHHHHHH-CONH2) American Peptide Company  custom synthesized, 7.5mg/mL
Complete medium RPMI-1640, 10% FBS, 1% Pen/Strep, 1% L-glutamine, 1% NEAA, 5mM HEPES, 50uM 2-Mercaptoethanol
RPMI-1640  Gibco 11879-020
FBS (Fetal Bovine Serum) Atlanta Biologicals S11150 Heat inactivated before use
Pen/Strep Gibco 15140-122
L-glutamine 200mM (100x) Gibco 25030-081
NEAA (non-essential amino acid) 100x Gibco 11140-050
1M HEPES BioWhittaker 17-737E
2-Mercaptoethanol (100X) Millipore ES-007-E
Platform shaker: The Belly Dancer Stovall Life Sciences Inc. model: USBDbo

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Tajima, A., Liu, W., Pradhan, I., Bertera, S., Lakomy, R. A., Rudert, W. A., Trucco, M., Meng, W. S., Fan, Y. Promoting 3-D Aggregation of FACS Purified Thymic Epithelial Cells with EAK 16-II/EAKIIH6 Self-assembling Hydrogel. J. Vis. Exp. (112), e54062, doi:10.3791/54062 (2016).

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