Summary

Die Förderung der 3-D-Aggregation von FACS Purified Thymusepithelzellen mit EAK 16-II / EAKIIH6 Selbstaufbau Hydrogels

Published: June 27, 2016
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Summary

This video demonstrates a protocol to enrich thymic epithelial cells (TECs) with density gradient for FACS isolation. It also shows the use of EAK16-II/EAKIIH6 peptides to promote the TEC aggregate formation. The microenvironments of EAK16-II/EAKIIH6 hydrogel provide the 3-D configuration necessary to maintain the survival and function of the TECs.

Abstract

Thymus involution, associated with aging or pathological insults, results in diminished output of mature T-cells. Restoring the function of a failing thymus is crucial to maintain effective T cell-mediated acquired immune response against invading pathogens. However, thymus regeneration and revitalization proved to be challenging, largely due to the difficulties of reproducing the unique 3D microenvironment of the thymic stroma that is critical for the survival and function of thymic epithelial cells (TECs). We developed a novel hydrogel system to promote the formation of TEC aggregates, based on the self-assembling property of the amphiphilic EAK16-II oligopeptides and its histidinylated analogue EAKIIH6. TECs were enriched from isolated thymic cells with density-gradient, sorted with fluorescence-activated cell sorting (FACS), and labeled with anti-epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) antibodies that were anchored, together with anti-His IgGs, on the protein A/G adaptor complexes. Formation of cell aggregates was promoted by incubating TECs with EAKIIH6 and EAK16-II oligopeptides, and then by increasing the ionic concentration of the medium to initiate gelation. TEC aggregates embedded in EAK hydrogel can effectively promote the development of functional T cells in vivo when transplanted into the athymic nude mice.

Introduction

Der Thymus ist die primäre lymphoiden Organ für die Erzeugung einer vielfältigen Population von pathogen-reaktives, selbst tolerant T-Zellen, die für die Funktion des erworbenen Immunsystems wesentlich ist. Es ist ein dynamisches Organ, in dem die Entwicklung Thymozyten aus dem Knochenmark als Lymphozyten-Vorläuferzellen immigrierte, wandern durch die schwammartige dreidimensionale (3-D) Matrix des Thymus-Stroma, durchlaufen abstammungs Spezifizierung und Differenzierung, und schließlich auswandern als reifen T-Zellen. Der Erfolg dieses gut programmiert Verfahren hängt weitgehend von der Kreuzkopplung zwischen den wandernden Thymozyten und den Wohn Thymus-Epithelzellen (TECs), die vorherrschende Bevölkerung des Thymus-Stroma, die für die Einrichtung und Aufrechterhaltung der Integrität des Thymus Mikroumgebung wesentlich sind.

Auf der Grundlage ihrer anatomischen Lage und einzigartige Funktion kann TECs in zwei Untergruppen unterteilt werden: die TECs in der Hirnrinde (CTEC), die Verant sindwortlich Selbst MHC (Major Histocompatibility Complex) beschränkt T-Zellen (positive Auswahl) und die TECs in der Medulla (mTEZ) , die zur Eliminierung autoreaktiver T-Zellen wesentlich sind (negative Selektion) 1,2 für die Auswahl. Viele Faktoren (zB Alterung, Infektion, Bestrahlung, medikamentöse Behandlungen) können irreversible Schäden an der Thymus – Epithel führen, in kompromittierten adaptive Immunität führt. Trotz zahlreicher Versuche hat die Thymusfunktion Wiederherstellung herausfordernd aufgrund der Schwierigkeit, den Thymus-Mikroumgebung zu reproduzieren. Bemerkenswerterweise ist thymic dreidimensionale (3-D) -Konfiguration entscheidend für das Überleben und die Funktion von TECs, während TECs kultiviert in einem 2-D – Umgebung schnell die Expression von Genen kritisch für Thymopoese 3,4 verringern.

EAK16-II (AEAEKAKAEAEAKAK) und dessen C-terminale histidinylated analogen EAKIIH6 (AEAEKAKAEAEAKAKHHHHHH) sind niedermolekulare, amphiphile Oligopeptide, die in deionisiertem gegen Ende der löslichenr, sondern gehen Gelieren β-Fibrillen zu bilden, wenn sie Ionenstärke von mehr als 20 mM NaCl (normale Salzkonzentration in der menschlichen Körperflüssigkeit beträgt 154 mM) ausgesetzt. Diese Umwelt reagierende Eigenschaft macht sie vielseitige Bausteine ​​3D-Strukturen zu bilden. Das His-Tag auf EAKII-H6 ein Andockmechanismus, durch welche die anti-His IgGs / Fc-bindenden rekombinantes Protein A / G (αH6: pA / G) -Komplexen als Adapter dienen können Proteinwirkstoffen und anderen Biomolekülen zu verankern ( zB Antikörper) auf dem Hydrogelverbundstoff 5-8.

Wir haben zuvor gezeigt , daß 9 bis zu 13 Tage an der Injektionsstelle fluoreszenzmarkierte IgG – Moleküle auf dem Hydrogel verankert können beibehalten werden. Wenn ferner die αH6: pA / G Adapter verankert mit anti-CD4 IgGs an das Hydrogel EAK16-II / EAKIIH6 (EAK) hinzugefügt wurden, wurden CD4 + T – Zellen spezifisch 10 eingefangen. Unter Verwendung ähnlicher Technik haben wir vor kurzem gezeigt, dass 3-D-Aggregation von TECs c(: PA / G: αEpCAM αH6) Ould mit Adapter Komplexe tragen TEC-spezifische anti-EpCAM-Antikörper in EAK Hydrogel gefördert werden. Wenn unterhalb der Nierenkapseln von nackten Mäusen transplantiert, können die TEC – Cluster in EAK Hydrogel eingebettet effektiv die Entwicklung von funktionellen T – Zellen in vivo 11,12 unterstützen.

Hier veranschaulichen wir unser Verfahren, um schnell und effektiv reinigen TECs mit fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) und Erzeugen 3-D TEC Aggregate mit dem EAK Hydrogelsystem.

Protocol

Alle Tiere in den Experimenten verwendet wurden in der Tierhaltung bei Allegheny-Singer Research Institute im Rahmen des Protokolls überprüft und genehmigt von der Institutional Animal Care und Use Committee des Allegheny Health Network / Allegheny Singer Research Institute untergebracht. 1. Verdauen des Thymus mit Kollagenase Ernte Thymusdrüse. Euthanize 3-5 Wochen alte C57BL6 / J – Mäusen in einem Kohlendioxid (CO 2) Kammer Thymusdrüse zu ernten. Im Einz…

Representative Results

Um die Wirksamkeit der Verwendung der Dichtegradiententrennung Protokoll untersuchen die CD45- Stromazellen zu bereichern, geerntete Zellen, sowohl von der Oberfläche und den ausgefällten Lymphozyten Pellets wurden mit anti-CD45 und anti-EpCAM-Antikörper. Sowohl anti-Ulex Europaeus Agglutinin 1 (UEA1) und Anti-MHC-Klasse II-Antikörper wurden auch in der Färbungs Cocktail aufgenommen, um die cTEC und mTEC Untergruppen identifizieren. Wie in Abbildung 1 gezeigt, konnt…

Discussion

Während TECs die vorherrschende Bevölkerung der Thymus-Stroma und spielen eine entscheidende Rolle für die Struktur und Funktion der Thymusdrüse sind, repräsentieren sie nur etwa 0,1-0,5% des gesamten Thymus Zellularität. Sie sind auch zerbrechlich Zellen als hohe Anteile an Zelltod werden gelegentlich folgenden Kollagenaseverdau beobachtet, dh die Behandlung TECs aus der extrazellulären Matrix (ECM) zu dissoziieren. Ihre Seltenheit (~ 200.000 pro Maus Thymus) und Zerbrechlichkeit machte es eine anspruch…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde zum Teil durch die National Institutes of Health gewährt R21 AI113000 (WSM) und R01 AI123392 (YF) unterstützt.

Materials

1. TEC Isolation
70% Ethanol Decon Laboratories 2701(1 Gallon) Ethanol 200 Proof, deionized water
Dissecting scissors, straight Fine Science Tools, Inc. 91460-11
Graefe forceps, straight Fine Science Tools, Inc. 11053-10
Graefe forceps, curved Fine Science Tools, Inc. 11052-10
Washing solution 1X PBS, 0.1% BSA, 2mM EDTA
1x PBS (Phosphate buffered saline) Gibco 10010-023
BSA (Bovine serum albumin) Sigma A1470-100G
EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) Invitrogen 15575-038
Digestion solution 9 mL RPMI-1640, 0.025 mg/mL Liberase TM Research grade, 10 mM HEPES, 0.2 mg/mL DNaseI
RPMI-1640 Gibco 11879-020
Liberase TM Research Grade Roche 05 401 127 001 referred as "purified collagenase"
1M HEPES Lonza 17-737E
Dnase I Roche 10 104 159 001
50mL Centrifuge tube Corning 430290
60mm tissue culture dish Falcon 353002
1/2cc U-100 Insulin syringe 28G1/2 Becton Dickinson 329461
5mL Polystyrene round-bottom tube Falcon 352058
5ml glass pipet Fisher Healthcare 13-678-27E Use for rinsing the thymic fragments. Thymic fragments tend to stick to the wall with plastic pipets.
MACSmix tube rotator Miltenyi 130-090-753
100um Cell strainer Falcon 352360
Density gradient medium: OptiPrep Axis-Shield
Name Company Catalog Number Comments
2. Cell sorting
5mL Polypropylene round-bottom tube Falcon 352063
Anti-mouse CD16/CD32 (Fc Block) BD Biosciences 553142 Use as undiluted, 2uL per sample
Anti-mouse CD45-PercpCy5.5 eBioscience 45-0451-80 Use at 1:150, 10uL per sample
Anti-mouse CD326 (EpCAM)-PE eBioscience 12-5791-82 Use at 1:100, 10uL per sample
BD Influx BD Biosciences
Single cell analysis software FlowJo
Name Company Catalog Number Comments
2. EAK gel assembly
Anti-His-Tag AnaSpec 29673 "anti-His-Tag IgG"
Purified anti-mouse CD326 (EpCAM) BioLegend 118202 "anti-EpCAM IgG"
Recombinant protein A/G Pierce Biotechnology
1.5mL Safe-Lock Tubes, Biopur, Sterile Fisher Healthcare 05-402-24B referred as "1.5mL microcentrifuge tube" 
96-well, Tissue culture plate, Round-bottom with low evaporation lid BD Falcon 353917
Rocking platform: Nutator Mixer no.1105 BD Clay Adams
10% sucrose Sigma S0389 Prepare with sterile distilled water
EAK16-II (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAK-CONH2) American Peptide Company  custom synthesized, 10mg/mL
EAKIIH6 (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAKHHHHHH-CONH2) American Peptide Company  custom synthesized, 7.5mg/mL
Complete medium RPMI-1640, 10% FBS, 1% Pen/Strep, 1% L-glutamine, 1% NEAA, 5mM HEPES, 50uM 2-Mercaptoethanol
RPMI-1640  Gibco 11879-020
FBS (Fetal Bovine Serum) Atlanta Biologicals S11150 Heat inactivated before use
Pen/Strep Gibco 15140-122
L-glutamine 200mM (100x) Gibco 25030-081
NEAA (non-essential amino acid) 100x Gibco 11140-050
1M HEPES BioWhittaker 17-737E
2-Mercaptoethanol (100X) Millipore ES-007-E
Platform shaker: The Belly Dancer Stovall Life Sciences Inc. model: USBDbo

References

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Tajima, A., Liu, W., Pradhan, I., Bertera, S., Lakomy, R. A., Rudert, W. A., Trucco, M., Meng, W. S., Fan, Y. Promoting 3-D Aggregation of FACS Purified Thymic Epithelial Cells with EAK 16-II/EAKIIH6 Self-assembling Hydrogel. J. Vis. Exp. (112), e54062, doi:10.3791/54062 (2016).

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