La promozione 3-D di aggregazione delle cellule FACS purificata timica epiteliali con EAK 16-II / EAKIIH6 autoassemblanti idrogel
Summary
This video demonstrates a protocol to enrich thymic epithelial cells (TECs) with density gradient for FACS isolation. It also shows the use of EAK16-II/EAKIIH6 peptides to promote the TEC aggregate formation. The microenvironments of EAK16-II/EAKIIH6 hydrogel provide the 3-D configuration necessary to maintain the survival and function of the TECs.
Abstract
Thymus involution, associated with aging or pathological insults, results in diminished output of mature T-cells. Restoring the function of a failing thymus is crucial to maintain effective T cell-mediated acquired immune response against invading pathogens. However, thymus regeneration and revitalization proved to be challenging, largely due to the difficulties of reproducing the unique 3D microenvironment of the thymic stroma that is critical for the survival and function of thymic epithelial cells (TECs). We developed a novel hydrogel system to promote the formation of TEC aggregates, based on the self-assembling property of the amphiphilic EAK16-II oligopeptides and its histidinylated analogue EAKIIH6. TECs were enriched from isolated thymic cells with density-gradient, sorted with fluorescence-activated cell sorting (FACS), and labeled with anti-epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) antibodies that were anchored, together with anti-His IgGs, on the protein A/G adaptor complexes. Formation of cell aggregates was promoted by incubating TECs with EAKIIH6 and EAK16-II oligopeptides, and then by increasing the ionic concentration of the medium to initiate gelation. TEC aggregates embedded in EAK hydrogel can effectively promote the development of functional T cells in vivo when transplanted into the athymic nude mice.
Introduction
Il timo è l'organo linfoide primaria responsabile per la generazione di una popolazione eterogenea di cellule T auto-tolerant patogeno-reattivo che è essenziale per la funzione del sistema immunitario acquisito. Si tratta di un organo dinamico dove timociti di sviluppo, immigrarono dal midollo osseo come cellule linfociti progenitrici, migrano attraverso il tridimensionale (3-D) a matrice spugnosa dello stroma timico, sottoposti lineage-specifiche e differenziazione, e infine emigrare maturo T-cellule. Il successo di questo processo ben programmato dipende in gran parte sul cross-talk tra i timociti migrazione e le cellule epiteliali del timo residenziali (TEC), la popolazione predominante dello stroma timica che sono essenziali per stabilire e mantenere l'integrità del microambiente del timo.
Sulla base della loro posizione anatomica e funzione unica, TEC può essere suddiviso in due sottoinsiemi: TEC nella corteccia (CTEC) che sono responbile per la selezione di auto-MHC (complesso maggiore di istocompatibilità) limitato cellule T (selezione positiva), e le TEC nella midollare (mTECs) che sono essenziali per eliminare le cellule T autoreattive (selezione negativa) 1,2. Molti fattori (ad esempio, l'invecchiamento, infezioni, irradiazione, droga trattamenti) possono causare danni irreversibili per l'epitelio timico, con conseguente compromissione immunità adattativa. Nonostante i numerosi tentativi, ripristinando la funzione timica è stata difficile a causa della difficoltà di riprodurre il microambiente timico. In particolare, timica tridimensionale (3-D) configurazione è fondamentale per la sopravvivenza e la funzione del TEC, mentre TEC coltivate in un ambiente 2-D diminuire rapidamente l'espressione di geni critici per timopoiesi 3,4.
EAK16-II (AEAEKAKAEAEAKAK) e il suo C-terminale analogico histidinylated EAKIIH6 (AEAEKAKAEAEAKAKHHHHHH) sono a basso peso molecolare, oligopeptidi anfifilici che sono solubili in tardo deionizzatar, ma sottoposto gelificazione per formare beta fibrille quando esposto a forza ionica superiore a 20 mM NaCl (concentrazione salina normale in fluido corporeo umano è 154 mM). La struttura, situata reattivo ambientali li rende mattoni versatili per formare strutture in 3D. Il His-tag su EAKII-H6 fornisce un meccanismo di aggancio, con la quale gli anti-His IgG / Fc-legame proteina ricombinante A / G (αH6: pA / G) complessi possono servire come un adattatore per ancorare farmaci proteici e altre biomolecole ( ad esempio, anticorpi) sul idrogel composita 5-8.
Abbiamo precedentemente dimostrato che le molecole fluorescenti marcato IgG ancorate sul idrogel possono essere conservati al sito di iniezione per un massimo di 13 giorni 9. Inoltre, quando i αH6: adattatori pA / G ancorate con l'anti-CD4 IgG sono stati aggiunti al idrogel EAK16-II / EAKIIH6 (EAK), cellule T CD4 + sono stati specificamente catturati 10. Usando una tecnica simile, abbiamo recentemente dimostrato che il 3-D aggregazione di TEC could essere promosso in EAK idrogel con complessi di adattamento che trasportano gli anticorpi anti-EpCAM specifici-TEC (αH6: PA / G: αEpCAM). Quando trapiantato sotto le capsule reni di topi nudi, i grappoli TEC incorporato in EAK idrogel possono supportare efficacemente lo sviluppo di cellule T funzionali in vivo 11,12.
Qui illustriamo il nostro metodo di rapido ed efficace purificare TEC con l'ordinamento delle cellule di fluorescenza-attivato (FACS) e generare aggregati TEC 3-D con il sistema EAK idrogel.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mentre TEC sono la popolazione predominante dello stroma del timo e svolgono ruoli essenziali per la struttura e la funzione del timo, essi rappresentano solo circa il 0,1-0,5% della cellularità timica totale. Sono anche cellule fragili come alte percentuali di morte cellulare sono occasionalmente osservati dopo digestione collagenasi, cioè, il trattamento dissociare TEC dalla matrice extracellulare (ECM). La loro rarità (~ 200.000 al timo del mouse) e la fragilità reso un compito impegnativo per isolare TE…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato in parte dal National Institutes of Health concede R21 AI113000 (WSM) e R01 AI123392 (YF).
Materials
| 1. TEC Isolation | |||
| 70% Ethanol | Decon Laboratories | 2701(1 Gallon) | Ethanol 200 Proof, deionized water |
| Dissecting scissors, straight | Fine Science Tools, Inc. | 91460-11 | |
| Graefe forceps, straight | Fine Science Tools, Inc. | 11053-10 | |
| Graefe forceps, curved | Fine Science Tools, Inc. | 11052-10 | |
| Washing solution | 1X PBS, 0.1% BSA, 2mM EDTA | ||
| 1x PBS (Phosphate buffered saline) | Gibco | 10010-023 | |
| BSA (Bovine serum albumin) | Sigma | A1470-100G | |
| EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) | Invitrogen | 15575-038 | |
| Digestion solution | 9 mL RPMI-1640, 0.025 mg/mL Liberase TM Research grade, 10 mM HEPES, 0.2 mg/mL DNaseI | ||
| RPMI-1640 | Gibco | 11879-020 | |
| Liberase TM Research Grade | Roche | 05 401 127 001 | referred as "purified collagenase" |
| 1M HEPES | Lonza | 17-737E | |
| Dnase I | Roche | 10 104 159 001 | |
| 50mL Centrifuge tube | Corning | 430290 | |
| 60mm tissue culture dish | Falcon | 353002 | |
| 1/2cc U-100 Insulin syringe 28G1/2 | Becton Dickinson | 329461 | |
| 5mL Polystyrene round-bottom tube | Falcon | 352058 | |
| 5ml glass pipet | Fisher Healthcare | 13-678-27E | Use for rinsing the thymic fragments. Thymic fragments tend to stick to the wall with plastic pipets. |
| MACSmix tube rotator | Miltenyi | 130-090-753 | |
| 100um Cell strainer | Falcon | 352360 | |
| Density gradient medium: OptiPrep | Axis-Shield | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2. Cell sorting | |||
| 5mL Polypropylene round-bottom tube | Falcon | 352063 | |
| Anti-mouse CD16/CD32 (Fc Block) | BD Biosciences | 553142 | Use as undiluted, 2uL per sample |
| Anti-mouse CD45-PercpCy5.5 | eBioscience | 45-0451-80 | Use at 1:150, 10uL per sample |
| Anti-mouse CD326 (EpCAM)-PE | eBioscience | 12-5791-82 | Use at 1:100, 10uL per sample |
| BD Influx | BD Biosciences | ||
| Single cell analysis software | FlowJo | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2. EAK gel assembly | |||
| Anti-His-Tag | AnaSpec | 29673 | "anti-His-Tag IgG" |
| Purified anti-mouse CD326 (EpCAM) | BioLegend | 118202 | "anti-EpCAM IgG" |
| Recombinant protein A/G | Pierce Biotechnology | ||
| 1.5mL Safe-Lock Tubes, Biopur, Sterile | Fisher Healthcare | 05-402-24B | referred as "1.5mL microcentrifuge tube" |
| 96-well, Tissue culture plate, Round-bottom with low evaporation lid | BD Falcon | 353917 | |
| Rocking platform: Nutator Mixer no.1105 | BD Clay Adams | ||
| 10% sucrose | Sigma | S0389 | Prepare with sterile distilled water |
| EAK16-II (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAK-CONH2) | American Peptide Company | custom synthesized, 10mg/mL | |
| EAKIIH6 (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAKHHHHHH-CONH2) | American Peptide Company | custom synthesized, 7.5mg/mL | |
| Complete medium | RPMI-1640, 10% FBS, 1% Pen/Strep, 1% L-glutamine, 1% NEAA, 5mM HEPES, 50uM 2-Mercaptoethanol | ||
| RPMI-1640 | Gibco | 11879-020 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Atlanta Biologicals | S11150 | Heat inactivated before use |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | |
| L-glutamine 200mM (100x) | Gibco | 25030-081 | |
| NEAA (non-essential amino acid) 100x | Gibco | 11140-050 | |
| 1M HEPES | BioWhittaker | 17-737E | |
| 2-Mercaptoethanol (100X) | Millipore | ES-007-E | |
| Platform shaker: The Belly Dancer | Stovall Life Sciences Inc. | model: USBDbo |
References
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