Summary

קידום Aggregation 3-D של תאי אפיתל הרתי המטוהר FACS עם EAK 16-II / EAKIIH6 עצמית להרכבת הידרוג'ל

Published: June 27, 2016
doi:

Summary

This video demonstrates a protocol to enrich thymic epithelial cells (TECs) with density gradient for FACS isolation. It also shows the use of EAK16-II/EAKIIH6 peptides to promote the TEC aggregate formation. The microenvironments of EAK16-II/EAKIIH6 hydrogel provide the 3-D configuration necessary to maintain the survival and function of the TECs.

Abstract

Thymus involution, associated with aging or pathological insults, results in diminished output of mature T-cells. Restoring the function of a failing thymus is crucial to maintain effective T cell-mediated acquired immune response against invading pathogens. However, thymus regeneration and revitalization proved to be challenging, largely due to the difficulties of reproducing the unique 3D microenvironment of the thymic stroma that is critical for the survival and function of thymic epithelial cells (TECs). We developed a novel hydrogel system to promote the formation of TEC aggregates, based on the self-assembling property of the amphiphilic EAK16-II oligopeptides and its histidinylated analogue EAKIIH6. TECs were enriched from isolated thymic cells with density-gradient, sorted with fluorescence-activated cell sorting (FACS), and labeled with anti-epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) antibodies that were anchored, together with anti-His IgGs, on the protein A/G adaptor complexes. Formation of cell aggregates was promoted by incubating TECs with EAKIIH6 and EAK16-II oligopeptides, and then by increasing the ionic concentration of the medium to initiate gelation. TEC aggregates embedded in EAK hydrogel can effectively promote the development of functional T cells in vivo when transplanted into the athymic nude mice.

Introduction

התימוס הוא איבר הלימפה הראשי אחראי לייצור אוכלוסייה מגוונת של תאי הפתוגן-reactive, עצמי סובלני T כי הוא חיוני לתפקוד של מערכת החיסון הנרכשת. זהו איבר דינמי שבו thymocytes פיתוח, עלה ממח העצם כפי ובתאים הלימפוציטים, נודדים דרך מטריקס תלת מימדי דמוי ספוג (3-D) של stroma הרתי, לעבור השושלת-מפרט והבחנה, ובסופו של דבר להגר כפי בוגרת T-תאי. הצלחתו של תהליך מתוכנת היטב זה תלוי במידה רבה על הצטלבות בין thymocytes נודדות לתאי האפיתל מגורים הרתי (Tecs), האוכלוסייה השלטת של stroma הרתי החיוניים לקביעתם ולקיומם של שלמות במיקרו-סביבה של התימוס.

בהתבסס על המיקום האנטומי שלהם פונקציה ייחודית, Tecs ניתן לחלק לשתי קבוצות משנה: הטקאנים בקליפה (cTECs) כי הם responsible לבחירה עצמי MHC (מורכבי histocompatibility גדולים) מוגבל מתאי T (סלקציה חיובית), ואת Tecs ב הלשד (mTECs) כי הם חיוניים עבור ביטול אוטוריאקטיבים תאי T (סלקציה שלילית) 1,2. גורמים רבים (למשל, הזדקנות, זיהום, קרינה, התרופה טיפולים) יכול לגרום נזק בלתי הפיך האפיתל הרתי, וכתוצאה מכך חסינות אדפטיבית נפגעת. למרות ניסיונות רבים, משחזר את תפקוד הרתי כבר מאתגר בשל הקושי לשחזר את המיקרו-סביבה הרתי. יש לציין, הרתי תלת ממדי (3-D) תצורה היא קריטית להישרדות והתפקוד של Tecs, ואילו Tecs תורבת בסביבת 2-D במהירות להקטין את הביטוי של גנים קריטיים עבור 3,4 thymopoiesis.

EAK16-II (AEAEKAKAEAEAKAK) ו אנלוגי histidinylated C- מסוף שלה EAKIIH6 (AEAEKAKAEAEAKAKHHHHHH) הם משקל מולקולרי נמוך, oligopeptides amphiphilic כי הם מסיסים שתייה ללא יוניםr, אבל לעבור gelation ליצירת β-הסיבים כאשר הם נחשפים כוח יוניים גבוה מ -20 מ"מ NaCl (ריכוז מלח רגיל בנוזל הגוף האנושי הוא 154 מ"מ). נכס תגובה הסביבה זה גורם להם להיות אבני הבניין צדדי כדי ליצור מבנים 3D. The-התג שלו על EAKII-H6 מספק מנגנון עגינה, שבאמצעותו IgGs אנטי שלו / Fc מחייב חלבון רקומביננטי / G (αH6: PA / G) מתחמים יכולים לשמש מתאם לעגן תרופות חלבון ביומולקולות אחר ( למשל, נוגדנים) על מרוכבים הידרוג'ל 5-8.

אנחנו הוכחנו בעבר כי מולקולות ניאון שכותרתו IgG מעוגנות על הידרוג'ל ניתן להיעזר באזור הזריקה עד 13 ימים 9. יתר על כן, כאשר αH6: מתאמי הרשות / G מעוגן עם IgGs אנטי CD4 נוספו EAK16-II / EAKIIH6 (EAK) הידרוג'ל, תאי CD4 + T נתפסו במיוחד 10. באמצעות טכניקה דומה, אנחנו הוכחנו לאחרונה כי צבירת 3-D של ג Tecsולד יקודם הידרוג'ל EAK עם מתחמי מתאם נושאת נוגדנים אנטי EpCAM TEC-ספציפי (αH6: PA / G: αEpCAM). כאשר מושתלים מתחת קפסולות הכליות של עכברים בעירום, אשכולות TEC מוטבעים הידרוג'ל EAK יכולים לתמוך בפיתוח יעיל של תאי T התפקודיים in vivo 11,12.

כאן אנו מדגימים את השיטה שלנו לטהר Tecs במהירות וביעילות עם תא המופעל הקרינה מיון (FACS) וליצור 3-D אגרגטים TEC עם מערכת הידרוג'ל EAK.

Protocol

כל בעלי החיים המשמשים בניסויים שוכנו במתקן החיה במכון מחקר אלגני-זינגר תחת הפרוטוקול נבדק ואושר על ידי ועדת הטיפול בבעלי החיים המוסדיים השתמש המכון לחקר זינגר רשת בריאות אלגני / אלגני. 1. לעכל את התימוס עם Collagenase <ol style=";text-align:right;di…

Representative Results

כדי לבחון את האפקטיביות של השימוש בפרוטוקול ההפרדה שיפוע צפיפות להעשיר את תאי סטרומה CD45-, תאים שנקטפו משני הממשק ואת כדורי הלימפוציטים זירז הוכתמו אנטי CD45 ונוגדנים אנטי EpCAM. שני 1 אנטי Ulex Europaeus agglutinin (UEA1) ונוגדנים נגד MHC Class II נכללו גם קוקטייל מכתים להמ?…

Discussion

בעוד Tecs הם האוכלוסייה השלטת של stroma הרתי ולשחק תפקידים חיוניים עבור המבנה והתפקוד של בלוטות התימוס, הם מהווים רק 0.1-0.5% של cellularity הרתי הכולל. הם גם תאי שברירי כמו באחוזים גבוהים של מוות של תאים הם נצפו לעתים בעקבות עיכול collagenase, כלומר, הטיפול לנתק Tecs מן מטריקס (ECM). הנד?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענקים R21 AI113000 (WSM) ו R01 AI123392 (YF).

Materials

1. TEC Isolation
70% Ethanol Decon Laboratories 2701(1 Gallon) Ethanol 200 Proof, deionized water
Dissecting scissors, straight Fine Science Tools, Inc. 91460-11
Graefe forceps, straight Fine Science Tools, Inc. 11053-10
Graefe forceps, curved Fine Science Tools, Inc. 11052-10
Washing solution 1X PBS, 0.1% BSA, 2mM EDTA
1x PBS (Phosphate buffered saline) Gibco 10010-023
BSA (Bovine serum albumin) Sigma A1470-100G
EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) Invitrogen 15575-038
Digestion solution 9 mL RPMI-1640, 0.025 mg/mL Liberase TM Research grade, 10 mM HEPES, 0.2 mg/mL DNaseI
RPMI-1640 Gibco 11879-020
Liberase TM Research Grade Roche 05 401 127 001 referred as "purified collagenase"
1M HEPES Lonza 17-737E
Dnase I Roche 10 104 159 001
50mL Centrifuge tube Corning 430290
60mm tissue culture dish Falcon 353002
1/2cc U-100 Insulin syringe 28G1/2 Becton Dickinson 329461
5mL Polystyrene round-bottom tube Falcon 352058
5ml glass pipet Fisher Healthcare 13-678-27E Use for rinsing the thymic fragments. Thymic fragments tend to stick to the wall with plastic pipets.
MACSmix tube rotator Miltenyi 130-090-753
100um Cell strainer Falcon 352360
Density gradient medium: OptiPrep Axis-Shield
Name Company Catalog Number Comments
2. Cell sorting
5mL Polypropylene round-bottom tube Falcon 352063
Anti-mouse CD16/CD32 (Fc Block) BD Biosciences 553142 Use as undiluted, 2uL per sample
Anti-mouse CD45-PercpCy5.5 eBioscience 45-0451-80 Use at 1:150, 10uL per sample
Anti-mouse CD326 (EpCAM)-PE eBioscience 12-5791-82 Use at 1:100, 10uL per sample
BD Influx BD Biosciences
Single cell analysis software FlowJo
Name Company Catalog Number Comments
2. EAK gel assembly
Anti-His-Tag AnaSpec 29673 "anti-His-Tag IgG"
Purified anti-mouse CD326 (EpCAM) BioLegend 118202 "anti-EpCAM IgG"
Recombinant protein A/G Pierce Biotechnology
1.5mL Safe-Lock Tubes, Biopur, Sterile Fisher Healthcare 05-402-24B referred as "1.5mL microcentrifuge tube" 
96-well, Tissue culture plate, Round-bottom with low evaporation lid BD Falcon 353917
Rocking platform: Nutator Mixer no.1105 BD Clay Adams
10% sucrose Sigma S0389 Prepare with sterile distilled water
EAK16-II (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAK-CONH2) American Peptide Company  custom synthesized, 10mg/mL
EAKIIH6 (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAKHHHHHH-CONH2) American Peptide Company  custom synthesized, 7.5mg/mL
Complete medium RPMI-1640, 10% FBS, 1% Pen/Strep, 1% L-glutamine, 1% NEAA, 5mM HEPES, 50uM 2-Mercaptoethanol
RPMI-1640  Gibco 11879-020
FBS (Fetal Bovine Serum) Atlanta Biologicals S11150 Heat inactivated before use
Pen/Strep Gibco 15140-122
L-glutamine 200mM (100x) Gibco 25030-081
NEAA (non-essential amino acid) 100x Gibco 11140-050
1M HEPES BioWhittaker 17-737E
2-Mercaptoethanol (100X) Millipore ES-007-E
Platform shaker: The Belly Dancer Stovall Life Sciences Inc. model: USBDbo

References

  1. Anderson, G., Jenkinson, E. J., Moore, N. C., Owen, J. J. MHC class II-positive epithelium and mesenchyme cells are both required for T-cell development in the thymus. Nature. 362, 70-73 (1993).
  2. Fan, Y., et al. Thymus-specific deletion of insulin induces autoimmune diabetes. The EMBO J. 28, 2812-2824 (2009).
  3. Mohtashami, M., Zuniga-Pflucker, J. C. Three-dimensional architecture of the thymus is required to maintain delta-like expression necessary for inducing T cell development. J Immunol. 176, 730-734 (2006).
  4. Pinto, S., et al. An organotypic coculture model supporting proliferation and differentiation of medullary thymic epithelial cells and promiscuous gene expression. J Immunol. 190, 1085-1093 (2013).
  5. Fung, S. Y., Yang, H., Chen, P. Formation of colloidal suspension of hydrophobic compounds with an amphiphilic self-assembling peptide. Colloids Surf B Biointerfaces. 55, 200-211 (2007).
  6. Jun, S., et al. Self-assembly of the ionic peptide EAK16: the effect of charge distributions on self-assembly. Biophys J. 87, 1249-1259 (2004).
  7. Saunders, M. J., et al. Engineering fluorogen activating proteins into self-assembling materials. Bioconjug Chem. 24, 803-810 (2013).
  8. Zhang, S., Holmes, T., Lockshin, C., Rich, A. Spontaneous assembly of a self-complementary oligopeptide to form a stable macroscopic membrane. Proc of the Natl Acad Sci U S A. 90, 3334-3338 (1993).
  9. Wen, Y., et al. Coassembly of amphiphilic peptide EAK16-II with histidinylated analogues and implications for functionalization of beta-sheet fibrils in vivo. Biomaterials. 35, 5196-5205 (2014).
  10. Zheng, Y., et al. A peptide-based material platform for displaying antibodies to engage T cells. Biomaterials. 32, 249-257 (2011).
  11. Tajima, A., et al. Bioengineering mini functional thymic units with EAK16-II/EAKIIH6 self-assembling hydrogel. Clin Immunol. 160, 82-89 (2015).
  12. Fan, Y., et al. Bioengineering Thymus Organoids to Restore Thymic Function and Induce Donor-Specific Immune Tolerance to Allografts. Mol Ther. 23, 1262-1277 (2015).
  13. Fan, Y., et al. Thymus-specific deletion of insulin induces autoimmune diabetes. The EMBO J. 28, 2812-2824 (2009).
  14. Fan, Y., et al. Compromised central tolerance of ICA69 induces multiple organ autoimmunity. J Autoimmun. 53, 10-25 (2014).
  15. Palumbo, M. O., Levi, D., Chentoufi, A. A., Polychronakos, C. Isolation and characterization of proinsulin-producing medullary thymic epithelial cell clones. Diabetes. 55, 2595-2601 (2006).
  16. Williams, K. M., et al. Single cell analysis of complex thymus stromal cell populations: rapid thymic epithelia preparation characterizes radiation injury. Clin Transl Sci. 2, 279-285 (2009).
  17. McLelland, B. T., Gravano, D., Castillo, J., Montoy, S., Manilay, J. O. Enhanced isolation of adult thymic epithelial cell subsets for multiparameter flow cytometry and gene expression analysis. J Immunol Methods. 367, 85-94 (2011).
  18. Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium. J Immunol methods. 385, 23-34 (2012).
  19. Xing, Y., Hogquist, K. A. Isolation, identification, and purification of murine thymic epithelial cells. J Vis Exp. , e51780 (2014).
  20. Graham, J. M. Separation of monocytes from whole human blood. ScientificWorldJournal. 2, 1540-1543 (2002).
  21. Li, X., Donowitz, M. Fractionation of subcellular membrane vesicles of epithelial and nonepithelial cells by OptiPrep density gradient ultracentrifugation. Methods Mol Biol. 440, 97-110 (2008).
  22. Mita, A., et al. Purification method using iodixanol (OptiPrep)-based density gradient significantly reduces cytokine chemokine production from human islet preparations, leading to prolonged beta-cell survival during pretransplantation culture. Transplant Proc. 41, 314-315 (2009).
  23. Anderson, G., Takahama, Y. Thymic epithelial cells: working class heroes for T cell development and repertoire selection. Trends Immunol. 33, 256-263 (2012).
  24. Kyewski, B., Klein, L. A central role for central tolerance. Annu Rev Immunol. 24, 571-606 (2006).
  25. St-Pierre, C., et al. Transcriptome sequencing of neonatal thymic epithelial cells. Sci Rep. 3, 1860 (2013).

Play Video

Cite This Article
Tajima, A., Liu, W., Pradhan, I., Bertera, S., Lakomy, R. A., Rudert, W. A., Trucco, M., Meng, W. S., Fan, Y. Promoting 3-D Aggregation of FACS Purified Thymic Epithelial Cells with EAK 16-II/EAKIIH6 Self-assembling Hydrogel. J. Vis. Exp. (112), e54062, doi:10.3791/54062 (2016).

View Video