Bozulmamış Arterlerin endotel katmanı Nitrik Oksit ve Süperoksit En Yüz Algılama
Summary
Bu yazıda floresan boya tr yüz eşzamanlı algılama ve hücre içi nitrik oksit görselleştirme (NO) ve süperoksit anyon (O 2 diaminofluorescein-2 diasetat (DAF-2DA) ve dihydroethidium (DHE) kullanarak adapte nispeten kolay bir yöntem tarif .- ) sırasıyla, taze bir obezite fare modelinin sağlam aorta izole edilmiştir.
Abstract
endotelyal NO sentaz (eNOS) üretilen Endotel türetilmiş nitrik oksit (NO), kardiyovasküler fizyoloji en önemli vazoprotektif moleküllerden biridir. ENOS ayrılması süperoksit anyon NO biyoyararlanım ve artış azalmaya yol olarak işlevsiz eNOS gibi (O 2 .-) üretim ve sırayla kardiyovasküler hastalıklar teşvik etmektedir. Bu nedenle, endotel hücreleri NO ve O 2 .- seviyelerinin uygun ölçüm kardiyovasküler hastalıklar ve komplikasyonları hakkında araştırma için hayati önem taşıyor. Çünkü NO ve O 2 .- son derece kararsız doğasından ötürü, herhangi bir önlem ve O 2 .- doğrudan kan damarına zordur. Birçok yöntem HAYIR ölçmek ve O 2 .- üretim için geliştirilmiştir. Ancak, her iki hassas olmayan ya da spesifik olmayan ya da teknik olarak zor ve özel ekipman gerektirmektedir. Burada bir adaptasyon tarifYüz eş zamanlı olarak saptanması ve hücre içi NO ve O 2 görselleştirme tr .- kaynaklı bir obezite fare modeli sağlam aorta sırasıyla, hücre geçirgen diaminofluorescein-2 diasetat (DAF-2DA) ve dihydroethidium (DHE) kullanarak floresan boya yöntemi yüksek yağ-diyet beslenme ile. Kontrol yalın fare ile karşılaştırıldığında Biz obezite fare taze izole edilmiş sağlam aorta 2 .- seviyeleri hücre içi NO azalmış ve O zengin oldukları olabilir. Bu yöntem, doğrudan algılama ve görselleştirme NO ve O 2 için kolay bir teknik, .- sağlam kan damarlarında ve yaygın (fizyo) patolojik koşullarda, endotelyal (dis) fonksiyonunun incelenmesi için uygulanabilir olduğunu göstermektedir.
Introduction
Vasküler endotelyal hücreler vazoaktif faktörlerin 1 serbest vasküler fonksiyonel ve yapısal bütünlüğünü korumak. Bu faktörler arasında, endotelyal NO sentazı (eNOS) ile L-arginin üretilen endotel kaynaklı nitrik oksit (NO), kardiyovasküler fizyoloji 2 en önemli ve en iyi karakterize edilen bir faktördür. NO dolayısıyla vasküler hastalık geliştirme 3 karşı koruma, endotel altı boşluğu içine trombosit agregasyonunu ve inflamatuar hücre yapışması ve infiltrasyonunu inhibe düz kas gevşemesi neden olur ve hücre çoğalmasını inhibe eder. Vb yaşlanma, hipertansiyon, diyabet, hiperlipidemi, aşağıdakileri içeren bir çok fizyolojik ve patolojik koşullar altında, karakterize endotel disfonksiyonu hiçbir biyolojik azalma ve O 2 .- üretimi mevcuttur ve ateroskleroz 2 patogenezi teşvik artmıştır. Son yıllarda yapılan çalışmalar eNOS ayrılması bir olduğunu göstermekÇeşitli yukarıda belirtilen koşullar 1,4 altında eNOS enzim O 2 ürettiği endotel disfonksiyonu, .- yerine NO için önemli bir mekanizma. Bu nedenle, endotelyal fonksiyon analizi, özellikle endotelyal NO üretimini ve O 2 .- nesil kardiyovasküler hastalıklar ve komplikasyonları hakkında deneysel araştırmalar için çok önemlidir.
analiz eden ve biyolojik örneklerdeki NO üretimini ölçmek için geliştirilmiş bir çok yöntem yaklaşım vardır. Ve NO – 3 – nedeniyle kolaylıkla NO 2 oksitlenir NO derece kararsız olmaları 3 sn 6 arasında bir yarı ömürle, hiçbir doğrudan ölçülmesi çok zordur. / NO – 3 – NO 2 nedenle saptanması sıvısı örneklerinde hücrelere veya dokulara 5 salınan NO indeksi olarak kullanılmıştır. Prosedür, nispeten kolay olmakla birlikte, bu yöntem, ancak, EA/ HAYIR 3 – – çözeltide bulunan sily istikrarlı NO 2 yüksek arka etkilenir. NO siklik guanozin monofosfat (cGMP) 6 üretilmesi için çözünebilir guanilat siklazı uyaran için hücresel cGMP düzeyi de hiçbir serbest 7 tahmin etmek için belirlenmiştir. Yine, bu dolaylı tahmini ve C-tipi natriüretik peptidin (CNP) gibi endotel kaynaklı faktörler de parçacık guanilat siklazın 8 aktivasyonu yoluyla cGMP düzeylerini artırmak olabilir, çünkü spesifik olmayabilir. NO yan ürün 9, L-sitrulin, üretiminin ölçülmesi, bu nedenle, aynı zamanda, NO üretimini tahmin etmek için dolaylı bir yöntem olarak kullanılabilir bir şekilde L-sitrulin üretimi ile L-arginin ile elde edilir. Bu yöntemin en önemli dezavantajı radyoaktif olduğunu ve biyoaktif NO düzeylerini ölçmek olmadığını vardır, O 2 NO hızla inaktive olabilir bıraktığından beri .-; Öte yandan, L-sitrulin l- için geri dönüştürülebilir10 arginin. Bu kimyasal aydınlatma 11, elektron spin rezonansı, 12 veya elektrokimyasal porphyrinic sensör 13 gibi diğer kimyasal yöntemler bazı araştırmacılar tarafından kullanılmıştır. Bu yöntemler, genellikle tespit prosedürleri işletim kolay değildir ve özel ekipman gerektirir. Birçok çalışma ile veya endotel fonksiyonunu değerlendirmek ve dolaylı olarak endotel kökenli NO aracılı vasküler relaksasyon ölçmek endotel olmadan izole kan damarları ile organ banyosu deneyleri uygulamak söz aynı zamanda. çoğunlukla fizyolojik duruma yakın, ama olmasına rağmen Ancak, bu yöntem, kesinlikle söylemek NO işlevi ölçmez, oldukça bir üretim eNOS fonksiyonunun net etkilerini yansıtan genel olarak endotel aracılı vazomotor yanıtları değerlendiren diğer endotel kökenli gevşetici faktörleri ve endotel kaynaklı sözleşme faktörleri, O 2 .- üretimi, ve düz kas hücrelerinin de yanıtlarıBu faktörler. ENOS işlevi veya NO üretiminin özel bir analiz genellikle 3 gereklidir.
Bizimki de dahil olmak üzere pek çok araştırma grupları YOK 14-19 hücre içi üretimini saptamak için floresan boya yöntemi kullanılan son yıllarda var. Bu yöntemde, hücre geçirgen floresan göstergesi diaminofluorescein-2 diasetat (DAF-2DA), in vitro ya da ex vivo hücre ve dokuları canlı kuru NO ve NOS fonksiyonu ölçmek için kullanılmıştır. prensibi canlı hücrelerde, DAF-2DA floresan olmayan 4,5-diaminofluorescein hücre içi esteraz suretiyle sitinin asetili alınır edilir bu o zaman ile reaksiyona sokularak DAF-2 triazol (DAF-2T) floresan dönüştürülmüştür (DAF-2) . DAF-2T floresan flöresanlı bir mikroskop veya flöresanlı konfokal mikroskop 14 altında gözlemlenebilir. Hücre içi floresan yoğunluğu dolayısıyla hücrelerde hücre içi NO üretimini veya sağlam kan vesse bir endotelyumuna yansıtırl. Böyle dihydroethidium (jeotermal) gibi belirli bir floresan boya ile birlikte, bir anda hücrelerde ya da kan damarlarında 14 hücre içi NO ve O 2 .- nesil değerlendirir. Benzer şekilde, DHE hücre geçirgen O 2 ile oksitlenir bileşik .- hücrelerin içinde ve daha sonra nükleik asitler ile intercalates floresan mikroskop veya floresan konfokal mikroskop ile kantitatif tespit edilebilen parlak kırmızı bir renk yayan oksidatif ürünü aynı zamanda. Bu, esas itibariyle, süperoksit radikalleri tespit hücreler tarafından iyi korunur ve hatta hafif tespit 20 tolere edilebilir DHE, O 2 .- biyolojik örneklerden saptanması için çok belirgin bir boyadır. Bu flöresan boyası yönteminin avantajlarından biri de tespit eder ve doğrudan bir oturma kan damarının sağlam endotel tabakası üzerinde cepheden NO ve / veya O 2 .- görselleştiren olmasıdır.
Bu sayfada,Bu floresan boya NO algılamak için yöntem ve O 2 .- biz yüz NO tespiti ve O 2 tr için adapte olması tarif .- yüksek yağ-diyet (YYD) besleme tarafından uyarılan bir obezite fare modeli sağlam aorta içinde. Biz bu yöntemi başarıyla ve güvenilir NO ve O 2 .- düzeylerini ölçmek ve obezite taze izole edilmiş sağlam fare aorta endotel tabakasında eNOS (dis) fonksiyonunu değerlendirmek olabilir göstermektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
NO ya da O 2 tespiti .- floresan boyalar ile çoğu zaman dokuya cryosections 23 da kültürlü endotelyal hücrelerde pek çok çalışmada kullanılan ve. Burada yüz NO tespiti ve O 2 .-, nispeten basit ve sezgisel etkili sırasıyla DAF-2DA ve jeotermal, ile endotel tabakasında düzeyleri tr, yani sağlam bir yaşam kan damarları, bu yöntemi genişletilmiş. Bir arter medyada elastik lifler, özellikle cryosections aorta belirli NO …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Swiss National Science Foundation (310030_141070/1), Swiss Heart Foundation, and National Center of Competence in Research (NCCR-Kidney.CH) Switzerland. Yu Yi is supported by the Chinese Scholarship Council.
Materials
| Dihydroethidium (DHE) | Invitrogen | D 1168 | dissolve with DMSO to 5 mmol/L as 1000X stock, stored at -20°C |
| Diaminofluorescein-2 Diacetate (DAF-2 DA) | Calbiochem | 251505 | dissolve with DMSO to 5 mmol/L as 1000X stock,stored at -20°C |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Invitrogen | D 1306 | dissolve with water to 300 µmol/L as 1000X stock,stored at 4°C |
| Mounting medium | Vector labor. (reactolab) | H-1000 | |
| L-Name (N o-nitro-l-argininemethylester.HCl) | Sigma-aldrich | A5751 | |
| Pentobarbital | Sigma-aldrich | P3636 | |
| Multi-Myograph System | Danish Myo Technology A/S | Model 610M | |
| Microscope | Nikon | SMZ800 | |
| Confocal microscope | Leica | DM6000 | |
| Image processing software | National Institute of Health(NIH) | Image J | |
| Surgical scissors | S&T AG | SDC-11 | |
| Microsurgical scissors | F.S.T | 15000-01 | |
| Forceps | S&T AG | JF-5 | |
| 26G×1/2ʺ syringe | Becton Dickinson | 305501 | |
| Coverslip round diam15mm | vwr | 631-1579 | |
| Tips 1 mL | vwr | RFL-1200c | |
| Tips 200 uL | vwr | 613.0659 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | |
| Acetylcholine chloride | Sigma-aldrich | A-6625 |
References
- Yang, Z., Ming, X. F. Arginase: the emerging therapeutic target for vascular oxidative stress and inflammation. Front Immunol. 4, 149 (2013).
- Forstermann, U., Sessa, W. C. Nitric oxide synthases: regulation and function. Eur Heart J. 33 (7), 829-837 (2012).
- Yang, Z., Ming, X. F. Recent advances in understanding endothelial dysfunction in atherosclerosis. Clin Med Res. 4 (1), 53-65 (2006).
- Kietadisorn, R., Juni, R. P., Moens, A. L. Tackling endothelial dysfunction by modulating NOS uncoupling: new insights into its pathogenesis and therapeutic possibilities. Am J Physiol Endocrinol Metab. 302 (5), 481-495 (2012).
- Green, L. C., Wagner, D. A., Glogowski, J., Skipper, P. L., Wishnok, J. S., Tannenbaum, S. R. Analysis of nitrate, nitrite, and [15N]nitrate in biological fluids. Anal. Biochem. 126 (1), 131-138 (1982).
- Knowles, R. G., Palacios, M., Palmer, R. M., Moncada, S. Formation of nitric oxide from L-arginine in the central nervous system: a transduction mechanism for stimulation of the soluble guanylate cyclase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86 (13), 5159-5162 (1989).
- Ishii, K., Sheng, H., Warner, T. D., Forstermann, U., Murad, F. A simple and sensitive bioassay method for detection of EDRF with RFL-6 rat lung fibroblasts. Am. J. Physiol. 261 (2), 598-603 (1991).
- Guo, H. S., et al. Inhibitory effect of C-type natriuretic peptide on spontaneous contraction in gastric antral circular smooth muscle of rat. Acta Pharmacol Sin. 24 (10), 1021-1026 (2003).
- Palmer, R. M., Ashton, D. S., Moncada, S. Vascular endothelial cells synthesize nitric oxide from L-arginine. Nature. 333 (6174), 664-666 (1988).
- Hecker, M., Sessa, W. C., Harris, H. J., Anggard, E. E., Vane, J. R. The metabolism of L-arginine and its significance for the biosynthesis of endothelium-derived relaxing factor: cultured endothelial cells recycle L-citrulline to L-arginine. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87 (21), 8612-8616 (1990).
- Kikuchi, K., Nagano, T., Hayakawa, H., Hirata, Y., Hirobe, M. Detection of nitric oxide production from a perfused organ by a luminol-H2O2 system. Anal. Chem. 65 (13), 1794-1799 (1993).
- Zweier, J. L., Wang, P., Kuppusamy, P. Direct measurement of nitric oxide generation in the ischemic heart using electron paramagnetic resonance spectroscopy. J. Biol. Chem. 270 (1), 304-307 (1995).
- Malinski, T., Mesaros, S., Tomboulian, P. Nitric oxide measurement using electrochemical methods. Methods Enzymol. 268, 58-69 (1996).
- Yu, Y., Rajapakse, A. G., Montani, J. P., Yang, Z., Ming, X. F. p38 mitogen-activated protein kinase is involved in arginase-II-mediated eNOS-Uncoupling in Obesity. Cardiovasc Diabetol. 13 (1), 113 (2014).
- Nakatsubo, N., et al. Direct evidence of nitric oxide production from bovine aortic endothelial cells using new fluorescence indicators: diaminofluoresceins. FEBS Lett. 427 (2), 263-266 (1998).
- Hink, U., et al. Mechanisms underlying endothelial dysfunction in diabetes mellitus. Circ Res. 88 (2), 14-22 (2001).
- Okuda, M., et al. Expression of glutaredoxin in human coronary arteries: its potential role in antioxidant protection against atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 21 (9), 1483-1487 (2001).
- Cortese-Krott, M. M., et al. Human red blood cells at work: identification and visualization of erythrocytic eNOS activity in health and disease. Blood. 120 (20), 4229-4237 (2012).
- Nunez, C., et al. Discrepancies between nitroglycerin and NO-releasing drugs on mitochondrial oxygen consumption, vasoactivity, and the release of NO. Circ Res. 97 (10), 1063-1069 (2005).
- Guzik, T. J., et al. Mechanisms of increased vascular superoxide production in human diabetes mellitus: role of NAD(P)H oxidase and endothelial nitric oxide synthase. Circulation. 105 (14), 1656-1662 (2002).
- Yang, Z., Ming, X. F. mTOR signalling: the molecular interface connecting metabolic stress, aging and cardiovascular diseases. Obes Rev. 13 (Suppl 2), 58-68 (2012).
- Yepuri, G., et al. Positive crosstalk between arginase-II and S6K1 in vascular endothelial inflammation and aging. Aging Cell. 11 (6), 1005-1016 (2012).
- Matsuno, K., et al. Nox1 is involved in angiotensin II-mediated hypertension: a study in Nox1-deficient mice. Circulation. 112 (17), 2677-2685 (2005).
