צמודים זיהוי פנים של Nitric Oxide ו Superoxide ב שכבת האנדותל של העורקים Intact
Summary
במאמר זה נתאר שיטה קלה מותאמת יחסית באמצעות צבע פלואורסצנטי diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2da) ו dihydroethidium (DHE) לגילוי סימולטני אן-פאס וויזואליזציה של תחמוצת חנקן תאית (NO) אניון סופראוקסיד (O 2 .- ) בהתאמה, טרי מבודד aortas השלם של מודל עכבר להשמנה.
Abstract
תחמוצת חנקן שמקורם האנדותל (NO) המופקת-synthase NO האנדותל (eNOS) היא אחת מולקולות vasoprotective החשובות ביותר בפיזיולוגיה קרדיווסקולרית. מתפקדת eNOS כגון שיחררה של eNOS גורמת להפחתת בשום הזמינות הביולוגית ואת הגידול אניון סופראוקסיד (O 2 .-) ייצור, ו בתורו מקדם מחלות לב וכלי דם. לכן, המידה המתאימה של NO ו- O 2 .- רמות לתאי אנדותל, הם מרכזיים למחקר על מחלות לב וכלי דם וסיבוכים. בשל אופיו היציב מאוד של NO ו- O 2 .-, קשה למדוד NO ו- O 2 .- ישירות בתוך כלי דם. שיטות רבות פותחו כדי למדוד NO ו- O 2 .- הייצור. היא, לעומת זאת, גם רגישה, או שאינה ספציפית, או תובענית מבחינה טכנית ודורשת ציוד מיוחד. כאן אנו מתארים לאימוצושיטת צבע קרינה עבור en איתור להדמיה סימולטני מול NO התאי ו- O 2 .- באמצעות diacetate החדיר diaminofluorescein-2 התאים (DAF-2da) ו dihydroethidium (DHE), בהתאמה, ב aortas השלם של מודל עכבר שמן נגרם על ידי האכלה עתירה שומן דיאטה. נוכל להוכיח ירד NO התאי ומשופרי O 2 .- רמות aortas השלם המבודד הטרי של עכבר שמן לעומת העכבר המלא הרזה. אנו מדגימים כי שיטה זו היא טכניקה קלה לגילוי ישיר ויזואליזציה של NO ו- O 2 .- בכלי הדם השלמים יכולה להיות מיושמת באופן נרחב לחקירה של האנדותל (פרע) פונקציה תחת (פיזיו) במצבים פתולוגיים.
Introduction
לתאי אנדותל כלי הדם לשמור על שלמות מבנית תפקודית וכלי דם על ידי שחרור גורמי vasoactive 1. בין גורמים אלה, תחמוצת החנקן שמקורם האנדותל (NO) המופק L-arginine באמצעות האנדותל NO-synthase (eNOS) הוא החשוב ביותר, איפיינו גורם בפיזיולוגיה קרדיווסקולרית 2. NO גורם להרפיית שרירים חלקים מעכב את שגשוג התאים, מעכב אגרגציה של טסיות הידבקות התא דלקתיות וחדירה לחלל subendothelial, ולכן הגנה מפני התפתחות מחלת כלי דם 3. תחת תנאים רבים פיזיולוגיים ופתולוגיים, כולל הזדקנות, יתר לחץ דם, סוכרת, היפרליפידמיה, וכו ', בתפקוד האנדותל מאופיין ירד NO הזמינות הביולוגית והגדילה O 2 הייצור .- קיים ומקדם טרשת העורקים 2. מחקרים מהשנים האחרונות מראים כי שחרר של eNOS הואמנגנון חשוב עבור תפקוד אנדותל, שבו אנזים eNOS מייצר O 2 .- במקום NO, בתנאים האמורים השונים 1,4. לכן, ניתוח של תפקוד האנדותל, בפרט, אנדותל NO ייצור O 2 .- הדור הוא מכריע למחקר ניסיוני על מחלות לב וכלי דם וסיבוכים.
ישנן גישות מתודולוגיות רבות פותחו כדי לנתח ולמדוד ייצור NO ב דגימות ביולוגיות. בשל אופיו של NO יציב מאוד אשר מתחמצן בקלות ל NO 2 – ו NO 3 – עם זמן מחצית חיים של 3 עד 6 שניות, קשה למדוד NO ישירות. לכן קביעת מס '2 – / NO 3 – בדגימות נוזל שימש כמדד NO להשתחרר תאים או רקמות 5. למרות ההליך הוא קל יחסית, השיטה היא, לעומת זאת, easily מושפע רקע גבוה של NO היציבה 2 – / NO 3 – כלול הפתרון. כי אף מגרת cyclase guanylate המסיסה לייצר monophosphate guanosine המחזורי (cGMP) 6, רמת cGMP הסלולר כן נקבעה להעריך NO שחרור 7. שוב, זה הינו הערכה עקיפה ולא יכול להיות ספציפי, מאז כמה גורמים הנגזרות האנדותל כגון פפטיד natriuretic C-type (CNP) יכול גם לשפר את רמות cGMP באמצעות הפעלת guanylate חלקיקי cyclase 8. NO מופק L-arginine עם דור של L-Citrulline כתוצר לוואי 9, מדידת ייצור L-Citrulline ולכן גם משמש כשיטה עקיפה להעריך NO ייצור. החסרונות העיקריים של שיטה זו הם כי הוא רדיואקטיבי והוא אינו מודד רמות NO ביו, מאז שוחרר NO יכול להיות מומת במהירות על ידי O 2 .-; יתר על כן, L-Citrulline ניתן למחזר כדי L-ארגינין 10. שיטות כימיות אחרות כגון זיהוי chemiluminescence 11, תהודת ספין אלקטרון 12, או porphyrinic אלקטרוכימיים NO חיישן 13 נמצאות בשימוש על ידי מספר חוקרים. שיטות אלה הן בדרך כלל לא קלות בהכנסות תפעוליות, נהלים לזיהוי דורשים ציוד מיוחד. זה גם להזכיר כי מחקרים רבים החל ניסויי אמבטית איבר עם כלי דם מבודדים עם או בלי האנדותל להעריך את תפקוד האנדותל ובעקיפין למדוד הקלות וסקולרית בתיווך NO נגזרות האנדותל. עם זאת, שיטה זו, אם כי בעיקר קרוב מצב פיסיולוגי, אבל בהחלט לומר, אינו מודד פונקציה ולא, זה דווקא מעריך תגובות וזומוטורים בתיווך האנדותל בכלל המשקפים תופעות נטו של פונקצית אינס, ייצור של אחרים נגזרות האנדותל הרגיע גורמים וגורם קבלנות נגזרות האנדותל, ייצור של O 2 .-, וגם התגובות של תאי שריר חלקלגורמים אלו. ניתוח ספציפי של פונקצית eNOS או NO ייצור נדרש בדרך כלל 3.
קבוצות מחקר רבות כולל שלנו יש בשנים האחרונות השתמשו בשיטה לצבוע קרינה לזהות ייצור תאי של NO 14-19. בשיטה זו מחוון הקרינה חדיר תא diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2da) שימש כדי למדוד את תפקוד NO ו NOS חינם בתאים חיים ורקמות במבחנה או vivo לשעבר. העיקרון הוא כי התאים החיים, DAF-2da הוא deacetylated ידי אסטראז תאיים ללא ניאון 4,5-diaminofluorescein (DAF-2) אשר היה ויומרו פלורסנט triazole DAF-2 (DAF-2T) על ידי מגיבים עם NO . הקרינה מן DAF-2T ניתן להבחין תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי או מיקרוסקופ confocal הקרינה 14. עוצמת הקרינה התאית ולכן משקפת את ייצור NO תאי בתאים או האנדותל של ב vesse דם ללא פגעl. בשילוב עם צבע פלואורסצנטי ספציפי כגון dihydroethidium (DHE), אפשר בו זמנית להעריך NO התאי ו- O 2 .- דור בתאים או בכלי דם 14. באופן דומה, DHE גם מתחם תא חדיר כי הוא מתחמצן על ידי O 2 .- בתוך התאים, ומוצר החמצונים אז intercalates עם חומצות גרעין לפלוט צבע אדום בוהק לגילוי כמותית על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי או confocal קרינה. DHE הוא צבע מאוד ספציפי לגילוי של O 2 .- מ דגימות ביולוגיות, כפי שהוא מזהה בעצם רדיקלים דיסמוטאז, נשמר היטב על ידי תאים, ואף עלול לסבול קיבעון מתון 20. אחד היתרונות של שיטת צבע הקרינה הזו היא שהיא מזהה מדמיין NO ו / או O 2 .- אן-פאס ישירות על שכבת האנדותל השלמה של כלי דם חיים.
במסמך הזה,אנו מתארים שיטה לצבוע קרינה זו כדי לזהות NO ו- O 2 .- אשר התאמנו עבור en זיהוי פן של NO ו- O 2 .- ב aortas השלם של מודל עכבר שמן הנגרמת על ידי דיאטה עשירה בשומן האכלה (HFD). אנו מראים כי שיטה זו יכולה סדירה ואמינה למדוד NO ו- O 2 .- רמות ולהעריך eNOS (פרע) פונקציה בשכבת האנדותל של aortas עכבר שלמים מבודדים טרי בהשמנה.
Protocol
Representative Results
Discussion
איתור של NO או O 2 .- עם צבעי ניאון שימש לעתים קרובות במחקרים רבים בתאי האנדותל תרבותי וגם cryosections רקמות 23. כאן הארכנו בשיטה זו כדי כלי הדם ללא פגע החיים, כלומר, en זיהוי פנים של NO ו- O 2 .- רמות בשכבת האנדותל עם DAF-2da ו DHE, בהתאמה, שהוא י…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Swiss National Science Foundation (310030_141070/1), Swiss Heart Foundation, and National Center of Competence in Research (NCCR-Kidney.CH) Switzerland. Yu Yi is supported by the Chinese Scholarship Council.
Materials
| Dihydroethidium (DHE) | Invitrogen | D 1168 | dissolve with DMSO to 5 mmol/L as 1000X stock, stored at -20°C |
| Diaminofluorescein-2 Diacetate (DAF-2 DA) | Calbiochem | 251505 | dissolve with DMSO to 5 mmol/L as 1000X stock,stored at -20°C |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Invitrogen | D 1306 | dissolve with water to 300 µmol/L as 1000X stock,stored at 4°C |
| Mounting medium | Vector labor. (reactolab) | H-1000 | |
| L-Name (N o-nitro-l-argininemethylester.HCl) | Sigma-aldrich | A5751 | |
| Pentobarbital | Sigma-aldrich | P3636 | |
| Multi-Myograph System | Danish Myo Technology A/S | Model 610M | |
| Microscope | Nikon | SMZ800 | |
| Confocal microscope | Leica | DM6000 | |
| Image processing software | National Institute of Health(NIH) | Image J | |
| Surgical scissors | S&T AG | SDC-11 | |
| Microsurgical scissors | F.S.T | 15000-01 | |
| Forceps | S&T AG | JF-5 | |
| 26G×1/2ʺ syringe | Becton Dickinson | 305501 | |
| Coverslip round diam15mm | vwr | 631-1579 | |
| Tips 1 mL | vwr | RFL-1200c | |
| Tips 200 uL | vwr | 613.0659 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | |
| Acetylcholine chloride | Sigma-aldrich | A-6625 |
References
- Yang, Z., Ming, X. F. Arginase: the emerging therapeutic target for vascular oxidative stress and inflammation. Front Immunol. 4, 149 (2013).
- Forstermann, U., Sessa, W. C. Nitric oxide synthases: regulation and function. Eur Heart J. 33 (7), 829-837 (2012).
- Yang, Z., Ming, X. F. Recent advances in understanding endothelial dysfunction in atherosclerosis. Clin Med Res. 4 (1), 53-65 (2006).
- Kietadisorn, R., Juni, R. P., Moens, A. L. Tackling endothelial dysfunction by modulating NOS uncoupling: new insights into its pathogenesis and therapeutic possibilities. Am J Physiol Endocrinol Metab. 302 (5), 481-495 (2012).
- Green, L. C., Wagner, D. A., Glogowski, J., Skipper, P. L., Wishnok, J. S., Tannenbaum, S. R. Analysis of nitrate, nitrite, and [15N]nitrate in biological fluids. Anal. Biochem. 126 (1), 131-138 (1982).
- Knowles, R. G., Palacios, M., Palmer, R. M., Moncada, S. Formation of nitric oxide from L-arginine in the central nervous system: a transduction mechanism for stimulation of the soluble guanylate cyclase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86 (13), 5159-5162 (1989).
- Ishii, K., Sheng, H., Warner, T. D., Forstermann, U., Murad, F. A simple and sensitive bioassay method for detection of EDRF with RFL-6 rat lung fibroblasts. Am. J. Physiol. 261 (2), 598-603 (1991).
- Guo, H. S., et al. Inhibitory effect of C-type natriuretic peptide on spontaneous contraction in gastric antral circular smooth muscle of rat. Acta Pharmacol Sin. 24 (10), 1021-1026 (2003).
- Palmer, R. M., Ashton, D. S., Moncada, S. Vascular endothelial cells synthesize nitric oxide from L-arginine. Nature. 333 (6174), 664-666 (1988).
- Hecker, M., Sessa, W. C., Harris, H. J., Anggard, E. E., Vane, J. R. The metabolism of L-arginine and its significance for the biosynthesis of endothelium-derived relaxing factor: cultured endothelial cells recycle L-citrulline to L-arginine. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87 (21), 8612-8616 (1990).
- Kikuchi, K., Nagano, T., Hayakawa, H., Hirata, Y., Hirobe, M. Detection of nitric oxide production from a perfused organ by a luminol-H2O2 system. Anal. Chem. 65 (13), 1794-1799 (1993).
- Zweier, J. L., Wang, P., Kuppusamy, P. Direct measurement of nitric oxide generation in the ischemic heart using electron paramagnetic resonance spectroscopy. J. Biol. Chem. 270 (1), 304-307 (1995).
- Malinski, T., Mesaros, S., Tomboulian, P. Nitric oxide measurement using electrochemical methods. Methods Enzymol. 268, 58-69 (1996).
- Yu, Y., Rajapakse, A. G., Montani, J. P., Yang, Z., Ming, X. F. p38 mitogen-activated protein kinase is involved in arginase-II-mediated eNOS-Uncoupling in Obesity. Cardiovasc Diabetol. 13 (1), 113 (2014).
- Nakatsubo, N., et al. Direct evidence of nitric oxide production from bovine aortic endothelial cells using new fluorescence indicators: diaminofluoresceins. FEBS Lett. 427 (2), 263-266 (1998).
- Hink, U., et al. Mechanisms underlying endothelial dysfunction in diabetes mellitus. Circ Res. 88 (2), 14-22 (2001).
- Okuda, M., et al. Expression of glutaredoxin in human coronary arteries: its potential role in antioxidant protection against atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 21 (9), 1483-1487 (2001).
- Cortese-Krott, M. M., et al. Human red blood cells at work: identification and visualization of erythrocytic eNOS activity in health and disease. Blood. 120 (20), 4229-4237 (2012).
- Nunez, C., et al. Discrepancies between nitroglycerin and NO-releasing drugs on mitochondrial oxygen consumption, vasoactivity, and the release of NO. Circ Res. 97 (10), 1063-1069 (2005).
- Guzik, T. J., et al. Mechanisms of increased vascular superoxide production in human diabetes mellitus: role of NAD(P)H oxidase and endothelial nitric oxide synthase. Circulation. 105 (14), 1656-1662 (2002).
- Yang, Z., Ming, X. F. mTOR signalling: the molecular interface connecting metabolic stress, aging and cardiovascular diseases. Obes Rev. 13 (Suppl 2), 58-68 (2012).
- Yepuri, G., et al. Positive crosstalk between arginase-II and S6K1 in vascular endothelial inflammation and aging. Aging Cell. 11 (6), 1005-1016 (2012).
- Matsuno, K., et al. Nox1 is involved in angiotensin II-mediated hypertension: a study in Nox1-deficient mice. Circulation. 112 (17), 2677-2685 (2005).
