En détection de visage de l'oxyde nitrique et de superoxyde dans la couche endothéliale des artères intactes
Summary
Dans cet article , nous décrivons une méthode relativement facile adaptée en utilisant le colorant fluorescent diaminofluorescéine-2 diacétate (DAF-2DA) et dihydroethidium (DHE) pour en face à la détection simultanée et la visualisation de l' oxyde nitrique intracellulaire (NO) et l' anion superoxyde (O 2 .- ) respectivement, fraîchement isolés aortes intactes d'un modèle d'obésité de la souris.
Abstract
l'oxyde nitrique endothélial (NO) produit à partir de NO-synthase endothéliale (eNOS) est l'une des molécules vasoprotecteurs les plus importantes dans la physiologie cardiovasculaire. Dysfonctionnel eNOS tel que le désaccouplement de la eNOS conduit à diminuer la biodisponibilité du NO et l' augmentation de l' anion superoxyde (O 2 .-) la production et à son tour , favorise les maladies cardiovasculaires. Par conséquent, la mesure appropriée de NO et O 2 .- niveaux dans les cellules endothéliales sont essentiels à la recherche sur les maladies cardiovasculaires et les complications. En raison de la nature extrêmement labile de NO et O 2 .-, il est difficile de mesurer le NO et O 2 .- directement dans un vaisseau sanguin. De nombreuses méthodes ont été mises au point pour mesurer le NO et O 2 .- production. Il est, cependant, que ce soit insensible ou non spécifique, ou techniquement exigeant et nécessite un équipement spécial. Nous décrivons ici une adaptationde la méthode de fluorescence de colorant pour en détection simultanée du visage et la visualisation des intracellulaire de NO et O 2 .- utilisant la cellule perméable diaminofluorescéine-2 diacétate (DAF 2DA) et dihydroethidium (DHE), respectivement, dans les aortes intactes d'un modèle d' obésité chez les souris induites par une forte teneur en matière grasse-régime alimentaire. Nous avons pu démontrer une diminution intracellulaire NO et O 2 .- amélioré les niveaux dans les aortes intactes fraîchement isolés de l' obésité souris par rapport à la commande souris maigre. Nous démontrons que cette méthode est une technique facile pour la détection directe et la visualisation de NO et O 2 .- dans les vaisseaux sanguins intacts et peut être largement appliquée pour l' étude de la fonction endothéliale (dys) sous (physio) conditions pathologiques.
Introduction
Les cellules endothéliales vasculaires maintiennent l' intégrité fonctionnelle et structurelle vasculaire en libérant des facteurs vasoactifs 1. Parmi ces facteurs, l' oxyde nitrique dérivé de l' endothélium (NO) produit à partir de L-arginine via NO-synthase endothéliale (eNOS) est le facteur le plus important et le mieux caractérisé en physiologie cardiovasculaire 2. NO provoque la relaxation des muscles lisses et inhibe la prolifération des cellules, inhibe l' agrégation plaquettaire et l' adhésion des cellules inflammatoires et une infiltration dans l'espace sous – endothélial, par conséquent , la protection contre le développement de maladies vasculaires 3. Dans de nombreuses conditions physiologiques et pathologiques, y compris le vieillissement, l' hypertension, le diabète, l' hyperlipidémie, etc., d'un dysfonctionnement endothélial , caractérisé par une diminution augmente la biodisponibilité du NO et O 2 .- production est présent et favorise la pathogenèse de l' athérosclérose 2. Les études de ces dernières années montrent que le désaccouplement de la eNOS est unmécanisme important pour la dysfonction endothéliale, dans laquelle l'enzyme eNOS génère O 2 .- au lieu de NO, dans les diverses conditions précitées 1,4. Par conséquent, l' analyse de la fonction endothéliale, en particulier, la production de NO endothelial et O 2 .- génération est essentielle pour la recherche expérimentale sur les maladies cardio – vasculaires et des complications.
Il existe de nombreuses approches méthodologiques qui ont été développés pour analyser et mesurer la production de NO dans des échantillons biologiques. En raison de la nature extrêmement labile de NO qui est facilement oxydé en NO 2 – et NO 3 – avec une demi-vie de 3 à 6 sec, il est difficile de mesurer NO directement. Par conséquent , la détermination de NO 2 – / NO 3 – dans les échantillons de fluide a été utilisé comme indice de NO libéré à partir de cellules ou de tissus 5. Bien que la procédure est relativement aisée, le procédé est, cependant, chsily affectée par un bruit de fond du NO stable 2 – / NO 3 – contenu dans la solution. Parce que NO stimule la guanylate cyclase soluble pour produire la guanosine monophosphate cyclique (GMPc) 6, le niveau de cGMP cellulaire a également été déterminée pour estimer la libération de NO 7. Encore une fois, ceci est une estimation indirecte et ne peut pas être spécifique, puisque certains facteurs de endothéliale tels que C-peptide natriurétique de type (CNP) pourrait également améliorer les niveaux de cGMP par l' activation de la guanylate cyclase particulaire 8. Le NO est produit à partir de la L-arginine avec la production de L-citrulline en tant que sous-produit 9, la mesure de la production de L-citrulline est donc également utilisée comme méthode indirecte d'estimation de la production de NO. Les inconvénients majeurs de ce procédé sont qu'il est radioactif et il ne permet pas de mesurer les niveaux de NO bioactif, puisque NO pourrait être libéré rapidement inactivée par O 2 .-; En outre, la L-citrulline peut être recyclé à L-10 l' arginine. D' autres méthodes chimiques telles que la détection de chimioluminescence 11, résonance de spin électronique 12, ou porphyrinique électrochimique NO capteur 13 sont utilisés par plusieurs chercheurs. Ces méthodes ne sont généralement pas faciles à exploiter, les procédures de détection et nécessitent un équipement spécial. Il est également de mentionner que de nombreuses études appliquent des expériences de bain d'organe avec les vaisseaux sanguins isolés avec ou sans l'endothélium pour évaluer la fonction endothéliale et indirectement mesurer NO médiée relaxations vasculaires endothéliales dérivés. Cependant, cette méthode, même si elle est le plus souvent proche de la situation physiologique, mais strictement à-dire, ne mesure pas NO fonction, il évalue plutôt les réponses vasomotrices endothélium médiée en général qui reflètent les effets nets de la fonction eNOS, la production d'autres endothélial détente les facteurs et les facteurs contractants endothéliale, la production de O 2 .-, ainsi que les réponses des cellules musculaires lissesà ces facteurs. Une analyse spécifique de la fonction eNOS ou la production de NO est habituellement exigé 3.
De nombreux groupes de recherche , y compris la nôtre ont, ces dernières années utilisé la méthode de colorant fluorescent pour détecter la production intracellulaire de NO 14-19. Dans cette méthode , la cellule indicateur de fluorescence perméable diaminofluorescéine-2 diacétate (DAF-2DA) a été utilisé pour mesurer la fonction libre NO et NO dans les cellules et tissus in vitro ou ex vivo vivant. Le principe est que dans les cellules vivantes, DAF-2DA est désacétylé par une estérase intracellulaire non fluorescent 4,5-diaminofluorescéine (DAF-2) qui a été ensuite converti en fluorescent DAF-2 triazole (DAF-2T) par réaction avec le NO . La fluorescence du DAF-2T peut être observée sous un microscope à fluorescence ou un microscope à fluorescence confocale à 14. L'intensité de fluorescence intracellulaire reflète donc la production de NO intracellulaire dans les cellules ou l'endothélium intact d'un vesse dans le sangl. Combiné avec un colorant fluorescent spécifique tel que dihydroethidium (DHE), on peut évaluer à la fois intracellulaire de NO et O 2 .- génération dans les cellules ou dans les vaisseaux sanguins 14. De même, la DHE est également un composé cellulaire perméable qui est oxydé par O 2 .- intérieur des cellules, et le produit d'oxydation puis intercale avec des acides nucléiques à émettre une couleur rouge vif détectable quantitativement par microscope à fluorescence ou un microscope à fluorescence confocale. DHE est un colorant très spécifique pour la détection d'O 2 .- partir d' échantillons biologiques, comme il détecte essentiellement des radicaux superoxydes, est bien conservé par les cellules, et peut même tolérer une légère fixation 20. L' un des avantages de cette méthode de fluorescence du colorant est qu'il détecte et visualise NO et / ou O 2 .- en surface directement sur la couche endotheliale intacte d'un vaisseau sanguin vivant.
Dans cet article,nous décrivons cette méthode de fluorescence de colorant pour détecter NO et O 2 .- que nous avons adapté pour en détection de visage de NO et O 2 .- dans les aortes intactes d'un modèle de souris de l' obésité induite par une forte teneur en matière grasse-alimentation (SIH) l' alimentation. Nous démontrons que cette méthode pourrait avec succès et de manière fiable de mesurer NO et O 2 .- niveaux et évaluer la fonction eNOS (dys) dans la couche endothéliale des aortes de souris intactes fraîchement isolées dans l' obésité.
Protocol
Representative Results
Discussion
Détection de NO ou O 2 .- avec des colorants fluorescents a été fréquemment utilisé dans de nombreuses études dans les cellules endothéliales en culture et aussi dans cryosections de tissus 23. Ici , nous avons étendu cette méthode pour les vaisseaux sanguins de vie intacte, à savoir, en détection de visage de NO et O 2 .- niveaux dans la couche endothéliale avec DAF-2DA et DHE, respectivement, ce qui est efficace, relativement…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Swiss National Science Foundation (310030_141070/1), Swiss Heart Foundation, and National Center of Competence in Research (NCCR-Kidney.CH) Switzerland. Yu Yi is supported by the Chinese Scholarship Council.
Materials
| Dihydroethidium (DHE) | Invitrogen | D 1168 | dissolve with DMSO to 5 mmol/L as 1000X stock, stored at -20°C |
| Diaminofluorescein-2 Diacetate (DAF-2 DA) | Calbiochem | 251505 | dissolve with DMSO to 5 mmol/L as 1000X stock,stored at -20°C |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Invitrogen | D 1306 | dissolve with water to 300 µmol/L as 1000X stock,stored at 4°C |
| Mounting medium | Vector labor. (reactolab) | H-1000 | |
| L-Name (N o-nitro-l-argininemethylester.HCl) | Sigma-aldrich | A5751 | |
| Pentobarbital | Sigma-aldrich | P3636 | |
| Multi-Myograph System | Danish Myo Technology A/S | Model 610M | |
| Microscope | Nikon | SMZ800 | |
| Confocal microscope | Leica | DM6000 | |
| Image processing software | National Institute of Health(NIH) | Image J | |
| Surgical scissors | S&T AG | SDC-11 | |
| Microsurgical scissors | F.S.T | 15000-01 | |
| Forceps | S&T AG | JF-5 | |
| 26G×1/2ʺ syringe | Becton Dickinson | 305501 | |
| Coverslip round diam15mm | vwr | 631-1579 | |
| Tips 1 mL | vwr | RFL-1200c | |
| Tips 200 uL | vwr | 613.0659 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | |
| Acetylcholine chloride | Sigma-aldrich | A-6625 |
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