En Face Detection оксида азота и супероксид в эндотелиальный слой малонарушенных артериях
Summary
В этой статье мы опишем , приспособленный относительно простой метод с использованием флуоресценции красителя diaminofluorescein-2 диацетат (DAF-2DA) и dihydroethidium (DHE) для фас одновременного обнаружения и визуализации внутриклеточного оксида азота (NO) и супероксиданиона (O 2 .- ) соответственно, в свежевыделенные неповрежденные аортах модели ожирения мыши.
Abstract
Эндотелием оксида азота (NO), произведенный из эндотелиальной NO-синтазы (Енос) является одним из наиболее важных вазопротективных молекул в сердечно-сосудистой физиологии. Неблагополучные Енос , такие как разобщение Эноса приводит к снижению NO биодоступности и увеличением супероксиданиона (O 2 .-) производства, а также в свою очередь , способствует сердечно – сосудистых заболеваний. Поэтому, соответствующее измерение NO и O 2 .- уровней в эндотелиальных клетках являются ключевыми для исследования сердечно – сосудистых заболеваний и осложнений. Из-за чрезвычайно лабильный характер NO и О 2 .-, что трудно измерить НЕТ и O 2 .- непосредственно в кровеносный сосуд. Многочисленные методы были разработаны для измерения NO и O 2 .- производство. Это, однако, либо нечувствительным или неспецифический, или технически сложных и требует специального оборудования. Здесь мы опишем адаптациюметода флуоресцентного красителя для фас одновременного обнаружения и визуализации внутриклеточного NO и O 2 .- с использованием клеточной проницаемой diaminofluorescein-2 диацетат (DAF-2DA) и dihydroethidium (ДНЕ), соответственно, в неповрежденных аортах модели ожирения мыши индуцированных путем кормления с высоким содержанием жиров-диеты. Мы могли бы продемонстрировать снизился внутриклеточного NO и повышение O 2 .- уровней в свежеизолированных неповрежденных аорте ожирения мышей по сравнению с контрольной постного мыши. Показано , что этот метод является простым методом для непосредственного обнаружения и визуализации NO и O 2 .- в неповрежденных кровеносных сосудов и может широко применяться для исследования эндотелиальной функции (DYS) при (физио) патологических состояний.
Introduction
Сосудистые эндотелиальные клетки сосудов сохранить функциональную и структурную целостность путем высвобождения вазоактивных факторов 1. Среди этих факторов, эндотелием оксида азота (NO) , полученного из L-аргинина с помощью эндотелиальной NO-синтазы (Енос) является наиболее важным и лучше всего характеризуется фактором в сердечно – сосудистой физиологии 2. НЕТ вызывает расслабление гладких мышц и ингибирует клеточную пролиферацию, ингибирует агрегацию тромбоцитов и воспалительную клеточную адгезию и проникновение в субэндотелиальном пространство, следовательно , защита против развития сосудистого заболевания 3. При многих физиологических и патологических состояний, в том числе старение, гипертензия, диабет, гиперлипидемия и т.д., дисфункция эндотелия характеризуется сниженная биодоступностью и увеличение O 2 .- производство присутствует и способствует патогенеза атеросклероза 2. Исследования, проведенные в последние годы, показывают, что разобщение Эноса являетсяВажным механизмом эндотелиальной дисфункции, в котором фермент Енос генерирует O 2 .- вместо NO, при различных вышеуказанных условиях 1,4. Таким образом, анализ эндотелиальной функции, в частности, эндотелиальной NO производства и O 2 .- поколение имеет ключевое значение для экспериментальных исследований сердечно – сосудистых заболеваний и осложнений.
Существуют многочисленные методологические подходы, которые были разработаны для анализа и не измерить никакого производства в биологических образцах. Из – за чрезвычайно лабильный характер NO , который легко окисляется до NO 2 – и NO 3 – с периодом полураспада от 3 до 6 сек, то измерить трудно NO напрямую. Поэтому определение NO 2 – / NO 3 – в жидких образцах использовали в качестве показателя NO высвобождаемого из клеток или тканей 5. Хотя процедура относительно легко, метод, однако, Э.А.Sily воздействию высокой фоне стабильного NO 2 – / NO – 3 , содержащегося в растворе. Поскольку NO стимулирует растворимую гуанилатциклазу для получения циклического гуанозинмонофосфата (цГМФ) 6, клеточный уровень цГМФ также установлено , чтобы оценить не высвобождают 7. Опять же , это косвенной оценки и не может быть специфическим, так как некоторые эндотелием факторы , такие , как С-типа натрийуретического пептида (CNP) также может повысить уровни цГМФ путем активации частиц гуанилатциклазы 8. ОТСУТСТВИЕ получают из L-аргинина с генерацией L-цитруллина в качестве побочного продукта , 9, измерение L-цитруллин производства, следовательно , также используется как косвенный метод, чтобы оценить продукцию NO. Основными недостатками этого метода является то, что он является радиоактивным и он не измеряет биоактивные уровни NO, так как НЕТ Наличие релиза может быть быстро инактивируется O 2 .-; Кроме того, L-цитруллин может быть переработана в L-Аргинин 10. Другие химические методы , такие как обнаружение хемилюминесценции 11, электронного спинового резонанса 12 или электрохимического порфиринового NO датчика 13 используются несколькими исследователями. Эти методы, как правило, не так просто в эксплуатации, процедуры обнаружения и требуют специального оборудования. Следует также отметить, что во многих исследованиях применяются эксперименты ванночку с изолированными кровеносных сосудов с или без эндотелием для оценки эндотелиальной функции и косвенного измерения эндотелием NO опосредованную сосудистых релаксаций. Тем не менее, этот метод, хотя он в основном близок к физиологической ситуации, но строго говоря, не не измеряет NO функции, она скорее оценивает эндотелий-опосредованные ответы вазомоторные в целом, отражающие характер влияния функции Enos, производство другой эндотелием отдыха факторы и эндотелием факторы Тунинг, производство O 2 .-, а также ответы клеток гладкой мускулатурык этим факторам. Конкретный анализ функции ENOS или NO производства, как правило , требуется 3.
Многие исследовательские группы , включая наши в последние годы использовали метод флуоресцентной красителя для обнаружения внутриклеточных производства NO 14-19. В этом методе индикаторный элемент проницаемой флуоресценции diaminofluorescein-2 диацетат (DAF-2DA) использовали для измерения NO и свободную функцию NOS в живых клетках и тканях в пробирке или экс естественных условиях. Принцип, что в живых клетках, ДАФ-2DA является деацетилируется внутриклеточным эстеразы к нефлуоресцентном 4,5-diaminofluorescein (DAF-2), который затем превращают в флуоресцентный DAF-2 триазола (DAF-2t) путем взаимодействия с NO , Флуоресценцию от DAF-2T можно наблюдать под флюоресцентным микроскопом или флуоресцентного конфокального микроскопа 14. В связи с этим интенсивность флуоресценции внутриклеточного отражает внутриклеточную продукцию NO в клетках или эндотелий показа в неповрежденной Вессе кровил. В сочетании со специфическим флуоресцентным красителем , такие как dihydroethidium (ДНЕ), можно одновременно оценить внутриклеточного NO и O 2 .- поколение в клетках или в кровеносных сосудах 14. Точно так же, ДНЕ также клетка-проницаема соединение , которое окисляется О 2 .- внутри клеток, и окислительное продукт затем встраивается с нуклеиновыми кислотами , чтобы излучать ярко – красный цвет обнаруживаемого количественно с помощью флуоресцентного микроскопа или флуоресцентного конфокального микроскопа. ДНЕ очень специфический краситель для обнаружения O 2 .- из биологических образцов, как она обнаруживает , по существу супероксидных радикалов, сохраняется хорошо клетками, и , возможно , даже переносят умеренную фиксацию 20. Одним из преимуществ этого метода флуоресценции красителя является то , что он обнаруживает и визуализирует NO и / или О 2 .- фас непосредственно на интактной эндотелиальной слой живой кровеносного сосуда.
В этой статье,мы опишем этот метод флуоресценции красителя для обнаружения NO и O 2 .- которую мы приспособили для собственной функции распознавания лиц от NO и O 2 .- в интактных аортах модели мышей с ожирением , вызванной высоким содержанием жира диета (HFD) кормления. Показано , что этот метод может успешно и надежно измерять NO и O 2 .- уровней и оценки функции Енос (DYS) в эндотелиальной слое свежеизолированных неповрежденных аорте мышей при ожирении.
Protocol
Representative Results
Discussion
Обнаружение NO или O 2 .- с помощью флуоресцентных красителей часто используется во многих исследованиях в культивируемых эндотелиальных клетках , а также в ткани криосрезах 23. Здесь мы расширили этот метод неповрежденными живых кровеносных сосудов, то есть, еп</em…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Swiss National Science Foundation (310030_141070/1), Swiss Heart Foundation, and National Center of Competence in Research (NCCR-Kidney.CH) Switzerland. Yu Yi is supported by the Chinese Scholarship Council.
Materials
| Dihydroethidium (DHE) | Invitrogen | D 1168 | dissolve with DMSO to 5 mmol/L as 1000X stock, stored at -20°C |
| Diaminofluorescein-2 Diacetate (DAF-2 DA) | Calbiochem | 251505 | dissolve with DMSO to 5 mmol/L as 1000X stock,stored at -20°C |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Invitrogen | D 1306 | dissolve with water to 300 µmol/L as 1000X stock,stored at 4°C |
| Mounting medium | Vector labor. (reactolab) | H-1000 | |
| L-Name (N o-nitro-l-argininemethylester.HCl) | Sigma-aldrich | A5751 | |
| Pentobarbital | Sigma-aldrich | P3636 | |
| Multi-Myograph System | Danish Myo Technology A/S | Model 610M | |
| Microscope | Nikon | SMZ800 | |
| Confocal microscope | Leica | DM6000 | |
| Image processing software | National Institute of Health(NIH) | Image J | |
| Surgical scissors | S&T AG | SDC-11 | |
| Microsurgical scissors | F.S.T | 15000-01 | |
| Forceps | S&T AG | JF-5 | |
| 26G×1/2ʺ syringe | Becton Dickinson | 305501 | |
| Coverslip round diam15mm | vwr | 631-1579 | |
| Tips 1 mL | vwr | RFL-1200c | |
| Tips 200 uL | vwr | 613.0659 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | |
| Acetylcholine chloride | Sigma-aldrich | A-6625 |
References
- Yang, Z., Ming, X. F. Arginase: the emerging therapeutic target for vascular oxidative stress and inflammation. Front Immunol. 4, 149 (2013).
- Forstermann, U., Sessa, W. C. Nitric oxide synthases: regulation and function. Eur Heart J. 33 (7), 829-837 (2012).
- Yang, Z., Ming, X. F. Recent advances in understanding endothelial dysfunction in atherosclerosis. Clin Med Res. 4 (1), 53-65 (2006).
- Kietadisorn, R., Juni, R. P., Moens, A. L. Tackling endothelial dysfunction by modulating NOS uncoupling: new insights into its pathogenesis and therapeutic possibilities. Am J Physiol Endocrinol Metab. 302 (5), 481-495 (2012).
- Green, L. C., Wagner, D. A., Glogowski, J., Skipper, P. L., Wishnok, J. S., Tannenbaum, S. R. Analysis of nitrate, nitrite, and [15N]nitrate in biological fluids. Anal. Biochem. 126 (1), 131-138 (1982).
- Knowles, R. G., Palacios, M., Palmer, R. M., Moncada, S. Formation of nitric oxide from L-arginine in the central nervous system: a transduction mechanism for stimulation of the soluble guanylate cyclase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86 (13), 5159-5162 (1989).
- Ishii, K., Sheng, H., Warner, T. D., Forstermann, U., Murad, F. A simple and sensitive bioassay method for detection of EDRF with RFL-6 rat lung fibroblasts. Am. J. Physiol. 261 (2), 598-603 (1991).
- Guo, H. S., et al. Inhibitory effect of C-type natriuretic peptide on spontaneous contraction in gastric antral circular smooth muscle of rat. Acta Pharmacol Sin. 24 (10), 1021-1026 (2003).
- Palmer, R. M., Ashton, D. S., Moncada, S. Vascular endothelial cells synthesize nitric oxide from L-arginine. Nature. 333 (6174), 664-666 (1988).
- Hecker, M., Sessa, W. C., Harris, H. J., Anggard, E. E., Vane, J. R. The metabolism of L-arginine and its significance for the biosynthesis of endothelium-derived relaxing factor: cultured endothelial cells recycle L-citrulline to L-arginine. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87 (21), 8612-8616 (1990).
- Kikuchi, K., Nagano, T., Hayakawa, H., Hirata, Y., Hirobe, M. Detection of nitric oxide production from a perfused organ by a luminol-H2O2 system. Anal. Chem. 65 (13), 1794-1799 (1993).
- Zweier, J. L., Wang, P., Kuppusamy, P. Direct measurement of nitric oxide generation in the ischemic heart using electron paramagnetic resonance spectroscopy. J. Biol. Chem. 270 (1), 304-307 (1995).
- Malinski, T., Mesaros, S., Tomboulian, P. Nitric oxide measurement using electrochemical methods. Methods Enzymol. 268, 58-69 (1996).
- Yu, Y., Rajapakse, A. G., Montani, J. P., Yang, Z., Ming, X. F. p38 mitogen-activated protein kinase is involved in arginase-II-mediated eNOS-Uncoupling in Obesity. Cardiovasc Diabetol. 13 (1), 113 (2014).
- Nakatsubo, N., et al. Direct evidence of nitric oxide production from bovine aortic endothelial cells using new fluorescence indicators: diaminofluoresceins. FEBS Lett. 427 (2), 263-266 (1998).
- Hink, U., et al. Mechanisms underlying endothelial dysfunction in diabetes mellitus. Circ Res. 88 (2), 14-22 (2001).
- Okuda, M., et al. Expression of glutaredoxin in human coronary arteries: its potential role in antioxidant protection against atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 21 (9), 1483-1487 (2001).
- Cortese-Krott, M. M., et al. Human red blood cells at work: identification and visualization of erythrocytic eNOS activity in health and disease. Blood. 120 (20), 4229-4237 (2012).
- Nunez, C., et al. Discrepancies between nitroglycerin and NO-releasing drugs on mitochondrial oxygen consumption, vasoactivity, and the release of NO. Circ Res. 97 (10), 1063-1069 (2005).
- Guzik, T. J., et al. Mechanisms of increased vascular superoxide production in human diabetes mellitus: role of NAD(P)H oxidase and endothelial nitric oxide synthase. Circulation. 105 (14), 1656-1662 (2002).
- Yang, Z., Ming, X. F. mTOR signalling: the molecular interface connecting metabolic stress, aging and cardiovascular diseases. Obes Rev. 13 (Suppl 2), 58-68 (2012).
- Yepuri, G., et al. Positive crosstalk between arginase-II and S6K1 in vascular endothelial inflammation and aging. Aging Cell. 11 (6), 1005-1016 (2012).
- Matsuno, K., et al. Nox1 is involved in angiotensin II-mediated hypertension: a study in Nox1-deficient mice. Circulation. 112 (17), 2677-2685 (2005).
