Представленные здесь простой метод для изоляции и потока цитометрии анализа глиомы инфильтрирующие мононуклеарных клеток периферической крови, что дает время зависит от количественных данных о количестве и состоянии активации иммунных клеток, входящих в ранней микросреду опухоли головного мозга.
В нашей лаборатории недавно показали, что естественные киллеры (NK) клетки способны ликвидации ортотопически имплантированный GL26 мыши и крысы ЦНС 1 злокачественных глиом вскоре после внутричерепной приживления, если раковые клетки оказываются несовершенными в их экспрессии β-галактозид лектин галектина -1 (Gal-1). Более поздние работы в настоящее время показывает, что население Gr-1 + / CD11b + миелоидных клеток имеет решающее значение для этой цели. Чтобы лучше понять механизмы, с помощью которых НК и миелоидных клеток сотрудничать, чтобы придать гал-1-дефицитных отторжение опухоли мы разработали комплексную протокол для выделения и анализа глиомы инфильтрирующие мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС). Метод демонстрируется здесь, сравнивая МКПК проникновение в опухолевую микросреду Гал-1-экспрессирующих GL26 глиомы с тех, кто оказался Гал-1-дефицитных помощью shRNA нокдаун. Протокол начинается с описания того, как к культуре и подготовить GL26 CEзаполняет для прививки в сингенной C57BL / 6J мозга мыши. Затем объясняет этапы в изоляции и потока цитометрии анализа глиомы инфильтрирующие МНПК от раннего микросреды опухоли головного мозга. Метод адаптируется к ряду в естественных экспериментальных конструкций, в которых требуется временные данные по иммунной инфильтрации в головном мозге. Метод чувствителен и высокой воспроизводимостью, а глиомы-проникновения РВМС могут быть выделены из внутричерепными опухолями, как только 24 ч после приживления опухоли с аналогичными количество клеток, наблюдаемых из точечных соответствует опухолей времени на протяжении независимых экспериментов. Один экспериментатор может выполнять способ лесозаготовок мозга течь цитометрический анализ глиомы инфильтрирующие МНПК в примерно 4-6 часов в зависимости от количества анализируемых образцов. Альтернативные модели глиомы и / или клеточно-специфические антитела обнаружения также могут быть использованы по усмотрению экспериментаторов "для оценки инфильтрации нескольких других ImmunТипы электронной клеток, представляющих интерес, без необходимости изменения в общей процедуре.
Глиомы представляют собой класс нейроэпителиальных рака головного мозга, вытекающих из трансформированной глии в центральной нервной системе (ЦНС). Из всех глиом, Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) класса IV глиомы, глиобластомы или (GBM), является наиболее распространенным и смертельный 1. GBM является весьма резистентны к текущей стандарт оказания медицинской помощи, которая состоит из удаления опухоли в максимально возможной степени с последующим излучением плюс сопутствующей и адъювантной химиотерапии темозоломидом 2. Эти смертоносные раки нести мрачный прогноз только 15-18 месяцев выживания с момента установления диагноза с только 5% больных, перенесших заболевание после 5 лет 3.
Наличие гематоэнцефалического барьера (ГЭБ), отсутствие профессиональных антиген-представляющих клеток (БТР), и ранее неизвестный наличие добросовестных лимфатических структур в мозге 4 привели к понятию GBM, как иммунной привилегированных. Тем не менее, многочисленные исследования в настоящее время шож, что эти рака мозга действительно порождают набор периферийных иммунных клеток, которые преимущественно миелоидной происхождения, которые включают моноциты, макрофаги, и миелоидных полученных клеток-супрессоров (MDSCs) 5. GBM также влияет на деятельность головного мозга резидентом микроглии стать про-онкогенные 6,7. Лимфоидных клеток, такие как CD8 + Т-клеток 8 и CD56 + натуральных киллеров 9 также присутствуют в опухоли микроокружения, но в гораздо меньшем количестве, факт считается, в связи с иммуносупрессивной функции спровоцированного глиомы, полученных факторов на ассоциированных с опухолью макрофаги ( ТАМ) 10. CD4 + T-клетки также присутствуют в GBM, но многое из этого населения также выражает CD25 и FoxP3, производители иммуносупрессивной T нормативной (T) клеток обл 11. Общая иммуносупрессивной состояние GBM завершается в продвижении иммунологической побега и опухолевой прогрессии 12.
<p class= "jove_content"> Более глубокое понимание механизмов иммуносупрессии GBM имеет решающее значение для разработки эффективных иммунотерапевтических стратегий, направленных на стимулирование иммунной системы против опухоли. За последние 15 лет наша лаборатория работала, чтобы преодолеть механизмы мозга опухоли immunosuppresson в целях развития эффективных новых анти-GBM Immunotherapeutics 13-19. Кульминацией этой работы в настоящее время привело к клиническому испытанию, предназначенный для оценки комбинированного цитотоксические и иммунной стимулирующее терапевтическое для пациентов с впервые выявленным GBM (ClinicalTrials.gov Identifier: NCT01811992).Наша последняя работа показывает, что GL26 мыши и крысы ЦНС 1 GBM клетки блокируют противоопухолевую НК клеток иммунного надзора по производству больших количеств β-галактозид лектина галектин-1 (Gal-1) 20. Это было продемонстрировано путем подавления экспрессии Gal-1 в клетках глиомы, используя shRNA-опосредованной генной нокдаун. В пробирке экспериментальTS показали, что Гал-1-дефицитных клеток глиомы распространение как правило, в культуре, но подверглись быстрому отказ вскоре после внутричерепного приживления сингенным C57BL / 6J или RAG1 – / – мышей, таким образом, установление независимости Т- или В- клеток на этом виде отказ опухоли. НК клеток immunodepletion с анти-асиало GM 1 анти-сыворотки или моноклональных антител NK1.1 привели к полному восстановлению внутричерепного Гал-1-дефицитных роста глиомы, устанавливающих роль NK-клеток в Гал-1-дефицитных отказа глиомы. Покажем теперь, что immunodepletion ГР-1 + / CD11b + миелоидной клетки достаточно, чтобы предотвратить гал-1-дефицитных отказ глиомы, несмотря на наличие NK клеток, таким образом, открывая незаменимым вспомогательную роль для миелоидных клеток в пособничестве в НК-опосредованной гал -1-дефицитных лизиса опухоли (неопубликованные данные). Этот неожиданный результат привел нас к разработке комплексной протокол для выделения и анализа мононуклеарных клеток периферической крови (МНПК), чтопроникнуть в микросреду опухоли мозга вскоре после внутричерепного приживления, чтобы мы могли лучше характеризуют иммунную инфильтрации события, которые предикатов гал-1-дефицитных отказ глиомы.
Метод демонстрируется здесь с помощью мыши GL26 глиомы клетки, которые конструктивно экспресс mCitrine флуоресцентный белок, называемый GL26-CIT, которые позволяют прямой визуализации опухолевых клеток с помощью флуоресцентной микроскопии 21. Эти клетки стереотаксически привиты в мозг сингенных C57BL / 6J и давали расти в течение 24, 48 или 72 ч до мыши эвтаназии. Глиомы инфильтрирующие РВМС затем выделяют и immunolabeled с использованием анти -CD45, -GR-1, -CD11b и -NK1.1 клеточной поверхности антитела вместе с внутриклеточной иммунноокрашивания для гранзима (GzmB). Это специфическое сочетание антител позволяет идентифицировать опухолевых инфильтрующих GR-1 + / CD11b-миелоидных клеток и NK1.1 +, NK клеток, клеточных типов имеем Вееп вовлечен в гал-1-дефицитных отторжение опухоли. Иммунная профиль инфильтрация гал-1-дефицитных GL26-чит глиомы, называемый здесь GL26-чит-gal1i, затем по сравнению с глиом, выражающих нормальные уровни Гал-1 под названием GL26-чит-НТ, которые содержат не- ориентации управления shRNA шпильку. Протокол начинается с описания о том, как культура GL26-Соч клеток глиомы в пробирке, которая сопровождается объяснением о том, как привить ортотопически эти клетки в стриатуме сингенным C57BL / 6J. Затем переходит перечислить этапы выделения и иммунноокрашивания глиомы инфильтрирующие МНПК для анализа потока цитометрии. Протокол заключает с объяснением стандартного анализа и графического представления.
Демонстрация показывает, что оба Гр-1 + / CD11b + миелоидных клеток и NK NK1.1 + клетки преимущественно накапливаются в гал-1-дефицитных опухолей головного мозга микросреды в 48ч имплантации опухоли, в результате которых помогает объяснить, почему эти опухоли быстро пройти полный лизис опухоли примерно 1 неделю после приживления опухоли 20. Способ может быть легко адаптирован к ряду различных естественных экспериментальных в конструкции, в которых требуется временные данные по иммунной инфильтрации в головном мозге. Один экспериментатор может выполнить протокол от уборки мозга течь цитометрический анализ глиомы инфильтрирующие МНПК примерно 4-6 часа в зависимости от количества анализируемых образцов. Способ также может быть объединена с экспериментов, направленных охарактеризовать профиль циркулирующего РВМС в мышей, несущих опухоли для сравнения с тем, что проникают в головной мозг, так, чтобы идентифицировать иммуносупрессии фенотипы частности, вызванные опухоли микроокружения. Применение этой и подобных методов должно способствовать лучшему пониманию факторов, участвующих в торговле периферийных иммунных клеток в опухоли микроокружения головного мозга.
Этот протокол описывает надежный и воспроизводимый метод для изоляции и проточной цитометрии анализа МНПК, которые проникли в начале мыши опухоли мозга микросреду. Глиомы клеточные суспензии генерируются в концентрации, указанной экспериментатора, которые привиты стереотаксически …
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была выполнена при поддержке Национального института здоровья / Национальный институт неврологических расстройств & Stroke (NIH / NINDS) предоставляет R01-R01, NS074387-NS057711 и R21-NS091555 к MGC; NIH / NINDS предоставляет R01-R01, NS061107-NS076991, R01-R21 и NS082311-NS084275 к ПРЛ; гранты от Лии Счастливые сердца, Мичиганский университет всеобъемлющем онкологического центра присуждена MGC и ПРЛ; Департамент нейрохирургии университета Мичигана в Школе медицины; Мичиган Институт клинической и исследования в области здравоохранения, при поддержке гранта NIH 2UL1-TR000433; Мичиганский университет биологии рака Обучение Грант поддерживается NIH / NCI (Национальный институт рака) гранта T32-CA009676; Мичиганского университета Обучение в клинических и фундаментальных Neuroscience поддерживается NIH / NINDS предоставить T32-NS007222; и Мичиганского университета Медицинской Программы подготовки Scientist поддерживается NIH / NIGMS (Национальный институт наук Общая медицина) предоставлять T32-GM007863. АвторыRe благодарны за академического руководства и поддержки, полученной от доктора Карин Muraszko и отделение нейрохирургии; М. Дальгрен, Д. TOMFORD, С. наполитан для превосходным административной поддержки; М. Dzaman за выдающиеся технической помощи; и Фил Дженкинс Ф. для щедрой поддержке к покупке Zeiss 3D Сканирующий электронный микроскоп. Мы также признаем, лаборатории Kuchroo в Гарвардской медицинской школе, из которой составлялся модифицированная версия медиа-опосредованной стратегии плотность центрифугирования для выделения мозга мононуклеарных клеток.
Dulbecco’s Modification of Eagles Medium | Gibco | 12430-054 | with 4.5g/L D-glucose, L-glutamine, 25mM HEPES and phenol red |
Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline | Gibco | 14190-144 | without calcium chloride or Magnesium chloride |
Fetal bovine serum | Omega Scientific Inc. | FB-11 | |
Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 10,000U/ml Penicillin; 10,000μg/ml Streptomycin |
L-glutamine | Gibco | 25030-081 | 200mM |
G418 sulfate | Omega Scientific Inc. | GN-04 | |
Puromycin dihydrochloride | Sigma-Aldrich | P8833 | from Streptomyces alboniger |
HyClone HyQTase non-mammalian trypsin alternative | Thermo Scientific | SV30030.01 | in DPBS with EDTA |
Phase contrast hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | 0.1mm deep |
Trypan blue stain | Gibco | 15250-061 | |
Sterile 0.9% NaCl injection, USP | Hospira | NDC: 0409-4888 | 10ml vials |
0.6ml conical polypropylenemi microtubes | Genesee Scientific | 22-272 | |
Atipamezole hydrochloride injection | Orion Pharma | NDC: 52483-6298 | 5mg/ml solution |
Ketamine hydrochloride injection | Fort Dodge | NDC: 0409-2051 | 100mg/ml solution |
Dexmedetomidine hydrochloride injection | Zoetis | NDC: 54771-2805 | 0.5mg/ml solution |
Xylazine hydrochloride injection | Lloyd | NDC: 61311-481 | 100mg/ml solution |
Carprofen injection | Pfizer | NDC: 61106-8501 | 50mg/ml solution |
Buprenorphine hydrochloride injection | Reckitt Benckiser | NDC: 12496-0757 | 0.3mg/ml ampuls |
1ml tuberculin syringes | Covidien | 8881501400 | |
26G x ½ (0.45mm x 13mm) syringe needles | BD | 305111 | |
Surgical clippers | 3M | 9661 | |
Providone-iodine solution | Aplicare | 82-217 | NDC: 52380-1905 |
Sterile petrolatum ophthalmic ointment | Dechra | NDC: 17033-211 | |
70% isopropyl alcohol prep pads | Kendall | 6818 | |
Sterile gauze | Covidien | 8044 | non-woven, 4" x 4", 4-ply |
1.7ml conical polypropylene microtubes | Genesee Scientific | 22-281 | |
Mouse stereotactic frame | Stoelting | 51730 | |
Surgical lamp | Philips Burton | CS316W | Coolspot II Variable Spotlight |
Curved dissecting forceps | Ted Pella Inc. | 5431 | |
Colibri retractors | FST | 17000-03 | |
Cordless precision power drill | Dremel | 1100-01 | Stylus model; 7.2-Volt Lithium-Ion with Docking Station |
Engraving Cutter | Dremel | 105 | 1/32" or 0.8 mm bit diameter |
Microliter syringe | Hamilton | 75 | Hamilton Microliter® Syringes 700 series; 5μl volume |
Microliter syringe needles | Hamilton | 7762-06 | 33G, small hub RN NDL, 1.5 in, point style 3, 6/PK |
Ethilon 3-0 black monofilament nylon sutures | Ethicon | 1663 | |
Magnetic stir bar | VWR | 74950-296 | 7.9mm diameter x 50mm length (5/16" diameter x 2" length) |
1L glass screw-cap storage bottle | Corning | 1395 | Type 1, Class A borosilicate glass |
Heparin sodium | Sagent | NDC: 25021-400 | 1,000U/ml solution |
Peristaltic pump | Cole Parmer Instruments Group | 77200-60 | Master Flex Easy Load II console drive |
compressed carbogen (95% O2 / 5% CO2) | available from local vendor | N/A | A-type, large cylinder |
20G x 1 ½" aluminum hub blunt needles | Kendall | 8881202363 | 0.9mm x 38.1mm |
Polyurethane ice bucket | Fisherbrand | 02-591-45 | Capacity: 0.152 oz. (4.5L) |
Collagenase (Type I-S) | Sigma Aldrich | C1639 | from Clostridium histolyticum |
Deoxyribonuclease I | Worthington Biochemical Corp. | LS002007 | >2,000 Kunitz units per mg dry weight |
Antistatic polystyrene hexagonal weighing dishes | Ted Pella Inc. | 20157-3 | top I.D. 115mm, base I.D. 85mm, 203ml volume |
Stainless steel single edged razor blades | Garvey | 40475 | |
Bone rongeurs | FST | 16001-15 | |
Hemostat | FST | 13014-14 | |
Large dissection scissors | Ted Pella Inc. | 1316 | |
Small dissection scissors | FST | 14094-11 | |
Blunt end forceps | Ted Pella Inc. | 13250 | |
7ml glass Dounce tissue grinder | Kontes | KT885300-0007 | |
Percoll Density Centrifugation Media | GE Healthcare | GE17-0891-01 | |
10 mL serological pipettes | Genesee Scientific | 12-104 | single use; sterile |
70μm sterile nylon mesh cell strainers | Fisherbrand | 22363548 | |
Alexa Fluor 700-conjugated rat anti-mouse CD45 (clone: 30-F11) | Biolegend | 103128 | |
APC-conjugated mouse anti-mouse NK1.1 (clone: PK136) | eBiosciences | 17-5941-82 | |
PE-conjugated rat anti-mouse Gr-1 (clone:RB6-8C5) | BD Pharmigen | 553128 | |
PerCP/Cy5.5-conjugated rat anti-mouse CD11b (clone: M1/70) | Biolegend | 101228 | |
Alexa Fluor 700-conjugated rat IgG2b, κ (clone: RTK4530) isotype control | Biolegend | 400628 | |
APC-conjugated mouse IgG2a, κ (clone: eBM2a) isotype control | eBioscience | 17-4724 | |
PE-conjugated rat IgG2b, κ (clone: eB149/10H5) isotype control | eBioscience | 12-4031-82 | |
PerCP/Cy5.5-conjugated rat IgG2b, κ (clone: RTK4530) isotype control | Biolegend | 400632 | |
Pacific Blue-conjugated mouse anti-mouse granzyme B (Clone: GB11) | Biolegend | 515403 | |
Pacific Blue-conjugated mouse IgG1, κ (Clone: MOPC-21) isotype control | Biolegend | 400151 | |
Cytofix/Cytoperm | BD | 554714 | |
15ml polypropylene centrifuge tubes | Genesee Scientific | 21-103 | conical bottom |
50ml polypropylene centrifuge tubes | Genesee Scientific | 21-108 | conical bottom |
12x75mm round-bottom polypropylene FACS tubes | Fisherbrand | 14-956-1B | |
FACSAria Special Order Research Product flow cytometer/cell sorter | BD | 650033 | |
Class II Biological Safety Cabinet | The Baker Company | SG603 | model: SterilGARD III Advance |