Hier voorgesteld is een eenvoudige methode voor het isoleren en flowcytometrische analyse van glioma infiltrerende perifere mononucleaire cellen die tijdsafhankelijk kwantitatieve gegevens over het aantal en activeringsstatus van immuuncellen die het begin hersentumor micro oplevert.
Ons laboratorium heeft onlangs aangetoond dat natuurlijke killer (NK) cellen in staat zijn het uitroeien orthotopically geïmplanteerde muizen GL26 en rat CNS-1 maligne glioom kort na intracraniale enting als de kankercellen deficiënt zijn weergegeven in hun expressie van de β-galactoside-bindende lectine galectine -1 (gal-1). Meer recent werk toont nu dat een bevolking van Gr-1 + / CD11b + myeloïde cellen is cruciaal voor dit effect. Om een beter inzicht in de mechanismen waarmee NK- en myeloïde cellen samen om gal-1-deficiënte tumor afstoting verlenen we hebben een uitgebreid protocol voor de isolatie en analyse van glioma-infiltrerende perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC) ontwikkeld. De werkwijze wordt hier aangetoond door PBMC infiltratie in de tumor micro-omgeving van gal-1-expressie GL26 gliomen met die rendered gal-1-deficiënte via shRNA knockdown. Het protocol begint met een beschrijving van hoe de cultuur en voor te bereiden GL26 ceLLS voor enting in de syngene C57BL / 6J muis hersenen. Het verklaart vervolgens de stappen die betrokken zijn bij de isolatie en flowcytometrische analyse van glioom infiltreren PBMC's uit het begin van de hersenen tumor micro. De werkwijze is aanpasbaar aan een aantal in vivo experimentele modellen waarin temporele gegevens immune infiltratie in de hersenen vereist. De werkwijze is gevoelig en zeer reproduceerbare, zoals glioom-infiltrerende PBMCs worden geïsoleerd uit intracraniale tumoren 24 uur na tumor implantatie met gelijke waargenomen vanaf tijdstip afgestemd tumoren gedurende onafhankelijke experimenten celtellingen hoogte. Eén experimentalist kan de werkwijze van hersenen oogst tot cytometrische analyse van glioma infiltrerende PBMCs stromen ongeveer 4-6 uur afhankelijk van het aantal te analyseren monsters. Alternatieve glioma modellen en / of cel-specifieke detectie antilichamen kunnen eveneens worden gebruikt ter beoordeling van experimentalisten om de infiltratie van een aantal andere immun beoordelene celtypen van belang, zonder de noodzaak voor wijziging van de algemene procedure.
Gliomen zijn een klasse van neuro hersenkanker voortvloeien uit getransformeerde glia binnen het centrale zenuwstelsel (CZS). Van alle gliomen, World Health Organization (WHO) graad IV glioma of glioblastoom (GBM) is de meest voorkomende en dodelijke 1. GBM is zeer ongevoelig is voor de huidige standaard-of-care bestaat uit tumorresectie zoveel mogelijk gevolgd door bestraling plus gelijktijdige en adjuvante chemotherapie met temozolomide 2. Deze dodelijke vormen van kanker dragen een sombere prognose slechts 15-18 maanden van overleving vanaf het moment van de initiële diagnose slechts 5% van de patiënten overleven van de ziekte na 5 jaar 3.
De aanwezigheid van de bloed-hersenbarrière (BBB), gebrek aan professionele antigenpresenterende cellen (APCs), en de eerder geïdentificeerde bestaan van bonafide lymfatische structuren binnen de hersenen 4 hebben geleid tot het begrip GBM immuun bevoorrecht. Echter, vele studies nu show dat deze hersenen kanker inderdaad wekken de werving van perifere immuuncellen die zijn overwegend myeloïde in oorsprong die monocyten, macrofagen, en myeloide suppressor cellen (MDSCs) 5 bevatten. GBM heeft ook invloed op de activiteit van de hersenen-resident microglia om pro-tumorigene 6,7 geworden. Lymfoïde cellen, zoals CD8 + T-cellen 8 en CD56 + natuurlijke killercellen 9 zijn ook aanwezig in de tumor micro-omgeving, maar in veel kleinere aantallen, een feit toe te schrijven aan immunosuppressieve werking aangezet door-glioom afgeleide factoren op tumor-geassocieerde macrofagen ( TAM) 10. CD4 + T-cellen zijn ook aanwezig in GBM, maar veel van deze populatie uit tevens CD25 en Foxp3, makers van immunosuppressieve regulerende T (T reg) cellen 11. De totale immunosuppressieve staat GBM culmineert in het bevorderen van immunologische ontsnappen en tumorprogressie 12.
<p class= "jove_content"> Een beter begrip van de mechanismen van GBM immunosuppressie is cruciaal voor de ontwikkeling van effectieve immunotherapeutische strategieën om het immuunsysteem te stimuleren tegen de tumor. In de afgelopen 15 jaar ons lab heeft gewerkt om de mechanismen van hersentumor immunosuppresson om effectieve nieuwe anti-GBM immunotherapeutics 13-19 ontwikkelen overwinnen. Het hoogtepunt van dit werk heeft nu geleid tot een klinische proef ontworpen om een gecombineerde cytotoxische en immuun-stimulerende therapeutische voor patiënten met nieuw gediagnosticeerde GBM (ClinicalTrials.gov Identifier: NCT01811992) te evalueren.Onze meest recente werk toont aan dat muis en rat CNS GL26-1 GBM cellen blokkeren anti-tumor NK cell immune surveillance door het produceren van grote hoeveelheden van de β-galactoside-bindende lectine galectine-1 (gal-1) 20. Dit werd aangetoond door het onderdrukken van de expressie van gal-1 in glioomcellen via shRNA gemedieerde gen knockdown. In vitro Experiments bleek dat gal-1-deficiënte glioomcellen gewoonlijk vermeerderd in cultuur, maar onderging een snelle afstoting kort na intracraniale enting in syngene C57BL / 6J of RAG1 – / – muizen, waardoor de onafhankelijkheid vaststelling van T- en B-cellen op deze vorm van tumor afstoting. NK cel immunodepletie met anti-asialo GM 1 anti- serum of monoklonale antilichamen NK1.1 geleid tot volledig herstel van intracraniale gal-1-deficiënte glioom groei, waardoor de rol van NK-cellen in gal-1-deficiënte glioom afstoting. We tonen nu dat immunodepletie van Gr-1 + / CD11b + myeloïde cellen voldoende om gal-1-deficiënte glioom afstoting ondanks de aanwezigheid van NK-cellen, dus een onmisbare ondersteunende rol van myeloïde cellen onthullend het verlenen van hulp NK-gemedieerde gal -1-deficiënte tumor lysis (ongepubliceerde gegevens). Deze onverwachte resultaat heeft geleid tot een algemeen protocol voor de isolatie en analyse van perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC's) ontstaan dieinfiltreren de hersenen tumor micro kort na intracraniële implantatie zodat we beter het immuunsysteem infiltratie gebeurtenissen die gal-1-deficiënte glioom afwijzing predikaat kunnen karakteriseren.
De methode wordt hier aangetoond met behulp van de muis GL26 glioom cellen die constitutief uitdrukkelijke mCitrine fluorescerend eiwit, genaamd GL26-Cit, dat directe tumorcel visualisatie mogelijk te maken door fluorescentiemicroscopie 21. Deze cellen worden geënt stereotactisch in de hersenen van syngene C57BL / 6J-muizen en kunnen groeien voor 24, 48 of 72 uur voorafgaand aan euthanasie muis. -Glioom infiltreren PBMC's worden vervolgens geïsoleerd en immunolabeled met behulp van anti -CD45, -GR-1, -CD11b en -NK1.1 celoppervlak antilichamen samen met intracellulaire immunolabeling voor granzyme B (GzmB). Deze specifieke combinatie van antilichamen maakt de identificatie van tumor infiltrerende Gr-1 + / CD11b + myeloïde cellen en NK1.1 + NK-cellen, celtypen we bEen betrokken bij gal-1-deficiënte tumor afstoting. De immune infiltratie profiel van gal-1-deficiënte GL26-Cit glioom, aangeduid hier als GL26-Cit-gal1i, wordt vervolgens vergeleken met die van gliomen expressie normale niveaus van gal-1 genoemd GL26-Cit-NT dat een niet bevatten targeting controle shRNA hairpin. Het protocol begint met een beschrijving over hoe de cultuur GL26-Cit glioom cellen in vitro, die wordt gevolgd door een uitleg over hoe orthotopically engraft deze cellen in het striatum van syngene C57BL / 6J muizen. Het gaat dan verder naar de stappen die betrokken zijn bij de isolatie en immunokleuring van glioma-infiltrerende PBMCs voor flowcytometrische analyse sommen. Het protocol wordt afgesloten met een toelichting van de standaard data-analyse en grafische weergave.
De demonstratie laat zien dat zowel Gr-1 + / CD11b + myeloïde cellen en NK1.1 + NK-cellen preferentieel ophopen in de gal-1-deficiënte hersenen tumor micro-omgeving binnen 48hr van de tumor implantatie, een resultaat dat helpt verklaren waarom deze tumoren sneller ondergaan volledige tumorlysis ongeveer 1 week na de tumor implantatie 20. De werkwijze is gemakkelijk aan een aantal verschillende in vivo experimentele modellen waarin temporele gegevens immune infiltratie in de hersenen vereist. Een enkele experimentalist kan het protocol uitvoeren van hersenen oogst tot cytometrische analyse van glioom infiltreren PBMCs stromen in ongeveer 4-6 uur, afhankelijk van het aantal monsters worden geanalyseerd. De werkwijze kan ook worden gecombineerd met experimenten gericht op het profiel van circulerende PBMCs in tumor dragende muizen ter vergelijking met die die de hersenen infiltreren zo te immunosuppressie fenotypes specifiek geïnduceerd door de tumor micro identificeren karakteriseren. De toepassing van deze en soortgelijke methoden moeten een beter begrip van de betrokken zijn bij de smokkel van perifere immuuncellen in de hersenen tumor micro factoren te vergemakkelijken.
Dit protocol beschrijft een robuuste en reproduceerbare werkwijze voor het isoleren en flowcytometrische analyse van PBMC die de vroege muizenhersenen tumor micro geïnfiltreerd. Glioom celsuspensies worden gegenereerd in een concentratie die door de experimentator die stereotactisch worden geënt in het striatum van de hersenen van muizen. Muizen worden vervolgens gedood op vooraf bepaalde tijdstippen gespecificeerd door het experimentele ontwerp en hun hersenen worden geoogst en verwerkt tot glioma infiltreren PBMCs d…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health / Nationaal Instituut voor Neurologische Aandoeningen en Stroke (NIH / NINDS) verleent R01-NS074387, R01-NS057711 en R21-NS091555 naar MGC; NIH / NINDS verleent R01-NS061107, R01-NS076991, R01-NS082311 en R21-NS084275 om PRL; subsidies van Leah's Happy Hearts, Universiteit van Michigan Comprehensive Cancer Center uitgereikt aan MGC en PRL; de afdeling Neurochirurgie, Universiteit van Michigan School of Medicine; Michigan Institute for Clinical and Health Research, ondersteund door NIH-subsidie 2UL1-TR000433; de Universiteit van Michigan Cancer Biology Training Grant ondersteund door NIH / NCI (National Cancer Institute) subsidie T32-CA009676; de Universiteit van Michigan Training in Klinische en Basic Neurowetenschappen ondersteund door NIH / NINDS verlenen T32-NS007222; en de Universiteit van Michigan Medical Scientist Training Program ondersteund door NIH / NIGMS (Nationaal Instituut voor Algemene Geneeskunde Wetenschappen) verlenen T32-GM007863. De auteurs van eenopnieuw dankbaar voor de wetenschappelijke leiding en ondersteuning ontvangen van Dr. Karin Muraszko en de afdeling Neurochirurgie; M. Dahlgren, D. TOMFORD en S. Napolitaanse voor een uitstekende administratieve ondersteuning; M. Dzaman voor uitstekende technische bijstand; en Phil F. Jenkins voor genereuze steun voor de aankoop van een Zeiss 3D Scanning Electron Microscope. We erkennen ook Kuchroo laboratorium Harvard Medical School, waaruit een gemodificeerde versie van de dichtheidscentrifugatie media-gemedieerde strategie voor het isoleren van mononucleaire cellen hersenen werd getrokken.
Dulbecco’s Modification of Eagles Medium | Gibco | 12430-054 | with 4.5g/L D-glucose, L-glutamine, 25mM HEPES and phenol red |
Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline | Gibco | 14190-144 | without calcium chloride or Magnesium chloride |
Fetal bovine serum | Omega Scientific Inc. | FB-11 | |
Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 10,000U/ml Penicillin; 10,000μg/ml Streptomycin |
L-glutamine | Gibco | 25030-081 | 200mM |
G418 sulfate | Omega Scientific Inc. | GN-04 | |
Puromycin dihydrochloride | Sigma-Aldrich | P8833 | from Streptomyces alboniger |
HyClone HyQTase non-mammalian trypsin alternative | Thermo Scientific | SV30030.01 | in DPBS with EDTA |
Phase contrast hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | 0.1mm deep |
Trypan blue stain | Gibco | 15250-061 | |
Sterile 0.9% NaCl injection, USP | Hospira | NDC: 0409-4888 | 10ml vials |
0.6ml conical polypropylenemi microtubes | Genesee Scientific | 22-272 | |
Atipamezole hydrochloride injection | Orion Pharma | NDC: 52483-6298 | 5mg/ml solution |
Ketamine hydrochloride injection | Fort Dodge | NDC: 0409-2051 | 100mg/ml solution |
Dexmedetomidine hydrochloride injection | Zoetis | NDC: 54771-2805 | 0.5mg/ml solution |
Xylazine hydrochloride injection | Lloyd | NDC: 61311-481 | 100mg/ml solution |
Carprofen injection | Pfizer | NDC: 61106-8501 | 50mg/ml solution |
Buprenorphine hydrochloride injection | Reckitt Benckiser | NDC: 12496-0757 | 0.3mg/ml ampuls |
1ml tuberculin syringes | Covidien | 8881501400 | |
26G x ½ (0.45mm x 13mm) syringe needles | BD | 305111 | |
Surgical clippers | 3M | 9661 | |
Providone-iodine solution | Aplicare | 82-217 | NDC: 52380-1905 |
Sterile petrolatum ophthalmic ointment | Dechra | NDC: 17033-211 | |
70% isopropyl alcohol prep pads | Kendall | 6818 | |
Sterile gauze | Covidien | 8044 | non-woven, 4" x 4", 4-ply |
1.7ml conical polypropylene microtubes | Genesee Scientific | 22-281 | |
Mouse stereotactic frame | Stoelting | 51730 | |
Surgical lamp | Philips Burton | CS316W | Coolspot II Variable Spotlight |
Curved dissecting forceps | Ted Pella Inc. | 5431 | |
Colibri retractors | FST | 17000-03 | |
Cordless precision power drill | Dremel | 1100-01 | Stylus model; 7.2-Volt Lithium-Ion with Docking Station |
Engraving Cutter | Dremel | 105 | 1/32" or 0.8 mm bit diameter |
Microliter syringe | Hamilton | 75 | Hamilton Microliter® Syringes 700 series; 5μl volume |
Microliter syringe needles | Hamilton | 7762-06 | 33G, small hub RN NDL, 1.5 in, point style 3, 6/PK |
Ethilon 3-0 black monofilament nylon sutures | Ethicon | 1663 | |
Magnetic stir bar | VWR | 74950-296 | 7.9mm diameter x 50mm length (5/16" diameter x 2" length) |
1L glass screw-cap storage bottle | Corning | 1395 | Type 1, Class A borosilicate glass |
Heparin sodium | Sagent | NDC: 25021-400 | 1,000U/ml solution |
Peristaltic pump | Cole Parmer Instruments Group | 77200-60 | Master Flex Easy Load II console drive |
compressed carbogen (95% O2 / 5% CO2) | available from local vendor | N/A | A-type, large cylinder |
20G x 1 ½" aluminum hub blunt needles | Kendall | 8881202363 | 0.9mm x 38.1mm |
Polyurethane ice bucket | Fisherbrand | 02-591-45 | Capacity: 0.152 oz. (4.5L) |
Collagenase (Type I-S) | Sigma Aldrich | C1639 | from Clostridium histolyticum |
Deoxyribonuclease I | Worthington Biochemical Corp. | LS002007 | >2,000 Kunitz units per mg dry weight |
Antistatic polystyrene hexagonal weighing dishes | Ted Pella Inc. | 20157-3 | top I.D. 115mm, base I.D. 85mm, 203ml volume |
Stainless steel single edged razor blades | Garvey | 40475 | |
Bone rongeurs | FST | 16001-15 | |
Hemostat | FST | 13014-14 | |
Large dissection scissors | Ted Pella Inc. | 1316 | |
Small dissection scissors | FST | 14094-11 | |
Blunt end forceps | Ted Pella Inc. | 13250 | |
7ml glass Dounce tissue grinder | Kontes | KT885300-0007 | |
Percoll Density Centrifugation Media | GE Healthcare | GE17-0891-01 | |
10 mL serological pipettes | Genesee Scientific | 12-104 | single use; sterile |
70μm sterile nylon mesh cell strainers | Fisherbrand | 22363548 | |
Alexa Fluor 700-conjugated rat anti-mouse CD45 (clone: 30-F11) | Biolegend | 103128 | |
APC-conjugated mouse anti-mouse NK1.1 (clone: PK136) | eBiosciences | 17-5941-82 | |
PE-conjugated rat anti-mouse Gr-1 (clone:RB6-8C5) | BD Pharmigen | 553128 | |
PerCP/Cy5.5-conjugated rat anti-mouse CD11b (clone: M1/70) | Biolegend | 101228 | |
Alexa Fluor 700-conjugated rat IgG2b, κ (clone: RTK4530) isotype control | Biolegend | 400628 | |
APC-conjugated mouse IgG2a, κ (clone: eBM2a) isotype control | eBioscience | 17-4724 | |
PE-conjugated rat IgG2b, κ (clone: eB149/10H5) isotype control | eBioscience | 12-4031-82 | |
PerCP/Cy5.5-conjugated rat IgG2b, κ (clone: RTK4530) isotype control | Biolegend | 400632 | |
Pacific Blue-conjugated mouse anti-mouse granzyme B (Clone: GB11) | Biolegend | 515403 | |
Pacific Blue-conjugated mouse IgG1, κ (Clone: MOPC-21) isotype control | Biolegend | 400151 | |
Cytofix/Cytoperm | BD | 554714 | |
15ml polypropylene centrifuge tubes | Genesee Scientific | 21-103 | conical bottom |
50ml polypropylene centrifuge tubes | Genesee Scientific | 21-108 | conical bottom |
12x75mm round-bottom polypropylene FACS tubes | Fisherbrand | 14-956-1B | |
FACSAria Special Order Research Product flow cytometer/cell sorter | BD | 650033 | |
Class II Biological Safety Cabinet | The Baker Company | SG603 | model: SterilGARD III Advance |