초기 뇌 종양 미세 환경에 진입 면역 세포의 수와 활성 상태에서 시간에 따른 양적 데이터를 산출 교종 함침 말초 혈액 단핵 세포의 분리 및 유세포 분석을위한 간단한 방법이 여기에서 제시 하였다.
우리 연구소는 최근 자연 살해 (NK) 세포가 암 세포가 β – 갈 락토 – 결합 렉틴 galectin의 발현에 결함이 렌더링되는 경우 두개 내 생착 후 CNS-1 악성 신경 교종 곧 동소 이식 마우스 GL26과 쥐를 박멸 할 수 있음을 보여 주었다 -1 (GAL-1). 최근의 연구는 지금 GR-1 + /는 CD11b + 골수 세포의 인구는이 효과에 중요한 것을 알 수있다. 더 NK와 골수 세포가 우리가 단리 교종 함침 말초 혈 단핵 세포 (PBMC)의 분석을위한 광범위한 프로토콜을 개발했다 GAL-1 결핍 종양 거부를 부여하기 위해 협력하는 메커니즘을 이해하기. 이 방법의 종양 미세 환경 내로 침투 PBMC를 비교하여 여기에서 설명된다 shRNA를 녹다운 통해 GAL-1 결핍 렌더링하는 것과 GL26 교종을 GAL-1 발현. 프로토콜에 대한 설명으로 시작하는 방법 문화와 GL26 가전을 준비동계 C57BL / 6J 마우스의 뇌에 접종에 대한 재편. 그러므로 초기 뇌 종양 미세 환경에서 신경 교종 함침 된 PBMC의 분리 및 유세포 분석에 관련된 단계를 설명한다. 상기 방법은 뇌에 면역 침윤 시간에 데이터를 필요로하는 생체 내 실험 디자인에 적용 할 수있다. 교종 함침 된 PBMC는 독립적 인 실험 내내 시점 유사한 종양에서 관찰 유사한 세포 수와 24 시간 후 종양 생착 자마자 두개 내 종양으로부터 분리 될 수있어서, 민감하고 재현성이다. 실험자들은 단일 분석 될 샘플의 수에 따라 약 4-6 시간에 신경 교종 함침 된 PBMC의 세포 계측 분석을 흐르게 뇌 적출에서 방법을 수행 할 수있다. 대안 교종 모델 및 / 또는 셀 특정 검출 항체는 또한 몇몇 다른 immun의 침윤을 평가 experimentalists '판단에 사용될 수있다전체적인 절차 변경 없이도 관심 E 세포 유형.
신경 교종은 중추 신경계 (CNS)에서 발생하는 변형 신경교 neuroepithelial 뇌암의 클래스이다. 모든 신경 교종의, 세계 보건기구 (WHO) 등급 IV 신경 교종, 또는 아교 모세포종 (GBM), 가장 일반적인 1 치명적이다. GBM은 테모 졸로 마이드 2 방사선 플러스 수반과 보조 화학 요법 다음에 가능한 범위에 종양 절제술로 구성되어 현재의 표준 진료에 매우 내화입니다. 이 치명적인 암 5 년 3 후에 질병을 생존 환자의 5 %와 초기 진단의 시간에서 생존의 15-18개월의 실력 예후를 수행한다.
혈액 뇌 장벽 (BBB)의 존재는, 전문적인 항원 제시 세포의 부족 (장갑차) 및 뇌 내에서 4 선의 림프 구조의 존재는 이전 미확인 특권 면역 GBM의 개념을 이끌어왔다. 그러나, 많은 연구가 지금 SHO이러한 뇌 암은 참으로 단핵구, 대 식세포 및 골수 유래 억제 세포 (MDSCs) (5)를 포함 기원에 주로 골수 있습니다 주변 면역 세포의 채용을 발생시킬 것을 승. GBM은 6,7 프로 종양 될 뇌 상주 미세 아교 세포의 활동에 영향을 미친다. 이러한 CD8 + T 세포 (8)과 CD56 + 자연 살해 세포 (9) 등의 림프 세포는 종양 미세 환경 내 존재하지만 훨씬 적은 숫자 생각 사실 (인해 종양 연관된 대 식세포에 신경 교종 – 유래 요인에 의해 유발 면역 기능 할 TAMS) 10. CD4 + T 세포는 GBM도 존재하지만이 인구의 대부분은 CD25 및 Foxp3를, 면역 T 규제 (T의 REG) 셀 (11)의 업체를 표현한다. GBM의 전반적인 면역 억제 상태는 면역 탈출 및 종양 진행 (12)의 증진에 절정.
<p class= "jove_content"> GBM 면역 억제의 메커니즘을 더 잘 이해는 종양에 대해 면역 체계를 자극하기위한 효과적인 면역 요법 전략의 개발에 중요하다. 지난 15 년 동안 우리 연구소는 효과적인 새로운 항 GBM의 immunotherapeutics 13-19을 개발하기 위해 뇌 종양 immunosuppresson의 메커니즘을 극복하기 위해 노력하고있다. 이 작품의 절정은 이제 새로 진단 GBM (: NCT01811992 ClinicalTrials.gov 식별자) 환자 결합 된 세포 독성 및 면역 자극 치료를 평가하기위한 임상 시험을 주도하고있다.가장 최근의 연구는 마우스 GL26 쥐 CNS -1- GBM 셀 β – 갈 락토 시드 – 결합 렉틴 galectin-1 (GAL-1) ~ (20)의 대량 생산함으로써 항암 NK 세포의 면역 감시를 차단하는 것으로 나타났다. 이것은 shRNA를 매개 유전자 녹다운을 사용하여 신경 교종 세포의 GAL-1의 발현을 억제함으로써 입증되었다. 시험 관내 experimenTS는 GAL-1 결핍 신경 교종 세포 배양에 정상적으로 증식 것으로 나타났다, 아직 동계 C57BL / 6J 또는 RAG1에 두개 내 생착 후 곧 빠른 거절을 시행 – / – 마우스, 따라서 이러한 형태에 T- 또는 B- 세포의 독립성을 확립 종양 제거. 안티 아시 알로 GM 1 항혈청 또는 GAL-1 결핍 신경 교종 제거에서 NK 세포의 역할을 설정하는 두개 GAL-1 결핍 교종 성장의 완전한 회복되었다 모노클 NK1.1 항체와 NK 세포 immunodepletion. 우리는 지금 GR-1 + /는 CD11b + 골수 세포의 immunodepletion 표시하는 따라서 NK 매개 GAL의 돕는데 골수 세포를위한 필수 불가결 한 보조 역할을 드러내는, NK 세포의 존재에도 불구하고 GAL-1 결핍 신경 교종 제거를 방지하기에 충분한 -1 결핍 종양 용해 (게시되지 않은 데이터). 이는 예기치 않은 결과는 말초 혈 단핵 세포의 분리 및 분석 (한 PBMC)를위한 광범위한 프로토콜을 개발할 주도했음을우리는 더 나은 GAL-1 결핍 신경 교종 거부 조건부 면역 침투 이벤트를 특성화 할 수 있도록 즉시 두개 내 생착 후 뇌 종양 미세 환경에 침투.
방법은 GL26-CIT를 불리는 구조적 익스프레스 mCitrine 형광 단백질은, 형광 현미경 (21)에 의해 직접 종양 세포의 가시화를 허용 GL26 마우스의 신경 교종 세포를 사용하여 여기에 설명된다. 이 세포들은 정위 동계 C57BL / 6J 마우스의 뇌에 접목하고, 이전에 마우스 안락사에 24, 48, 또는 72 시간 동안 성장을 사용할 수 있습니다. 신경 교종-침투 PBMC를 다음 항 -CD45를 사용하여 격리 및 immunolabeled되어, -GR-1, -CD11b과 그랜 자임 B의 세포 내 immunolabeling와 함께 -NK1.1 세포 표면 항체 (GzmB). 항체의 이러한 특정 조합이 우리가 B가 종양 침윤 GR-1 + / + CD11b를 골수 세포의 식별 및 NK1.1 +, NK 세포, 세포 유형을 허용EEN는 GAL-1 결핍 종양 제거에 관여. GAL-1 결핍 GL26-CIT의 신경 교종의 면역 침투 프로파일, GL26-CIT의-gal1i 여기에 언급하고 비를 포함 GAL-1 GL26-CIT의-NT 호출의 정상 수준을 발현하는 신경 교종의 것과 비교된다 제어 shRNA를 머리핀을 대상으로. 프로토콜 동소 동계 C57BL / 6J 마우스의 선조체로 이들 세포를 접목하는 방법에 대한 설명이 뒤 따른다 시험 관내 배양 방법 GL26-CIT의 신경 교종 세포에 대한 설명으로 시작한다. 그러므로 분리 및 유세포 분석 교종 함침 된 PBMC의 immunolabeling 관련된 단계를 열거 진행한다. 표준 프로토콜은 데이터 분석 및 그래픽 표현의 설명으로 종결.
데모는 밝혀 그 모두 GR-1 + /는 CD11b + 골수 세포와 NK1.1 + NK 세포 우선적으로 48 내 여자-1 결핍 뇌 종양 미세 환경 내에서 축적종양 주입,이 종양이 빠른 속도로 완전한 종양 용해 약 일주 후 종양 생착 (20)를 받아야하는 이유를 설명하는 데 도움이되는 결과의 시간. 상기 방법은 뇌에 면역 침윤 시간에 데이터를 필요로하는 생체 내 다양한 실험 디자인에 용이하게 적응할 수있다. 실험자들은 단일 분석 될 샘플의 수에 따라 약 4-6 시간에 신경 교종 함침 된 PBMC의 세포 계측 분석을 흐르게 뇌 적출로부터 프로토콜을 수행 할 수있다. 방법은 또한 특히 종양 미세 환경에 의해 유도 된 면역 표현형을 식별하도록 뇌 침투 것들과의 비교를 위해 종양 함유 마우스에서 PBMC를 순환 프로파일을 특성화하기 위해 실험 목적과 결합 될 수있다. 이것과 유사한 방법을 적용 뇌 종양 미세 환경 내로 말초 면역 세포의 거래에 관련된 요인의 더 나은 이해를 용이하게한다.
이 프로토콜은 초기 마우스 뇌 종양 미세 환경에 침투 한 한 PBMC의 분리 및 유세포 분석을위한 견고하고 재생 가능한 방법을 설명한다. 신경 교종 세포 현탁액 정위 마우스 뇌의 선조체에 접목 된 실험자에 의해 지정된 농도로 생성된다. 마우스는 다음 실험 디자인에 의해 지정된 소정의 시점에서 안락사 그들의 뇌를 수거하고, 형광 접합 된 일차 항체의 조합으로되어 immunolabeled 교종 함침 한 PBMC?…
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 신경 질환 및 뇌졸중 (NIH / NINDS) MGC에 R01-NS074387, R01-NS057711 및 R21-NS091555 부여의 / 국립 연구소 건강의 국립 연구소에 의해 지원되었다; NIH / NINDS는 PRL에 R01-NS061107, R01-NS076991, R01-NS082311 및 R21-NS084275을 부여; 레아의 행복한 마음에서 보조금, MGC 및 PRL에게 수여 미시간 종합 암 센터의 대학; 신경 외과, 의학 미시간 대학의 대학의 부; NIH 보조금 2UL1-TR000433 지원하는 임상에 대한 미시간 연구소 및 건강 연구,; NIH / NCI (국립 암 연구소) 부여 T32-CA009676에 의해 지원되는 미시간 대학 암 생물학 교육 보조금; NIH / NINDS 지원하는 임상과 기초 신경 과학 미시간 교육 대학은 T32-NS007222을 부여; 그리고 NIH / NIGMS (일반 의학 과학의 국립 연구소)에 의해 지원 미시간 의료 과학자 교육 프로그램의 대학은 T32-GM007863을 부여합니다. 저자박사 카린 Muraszko 및 신경 외과의 부서에서받은 교육 리더십과 지원에 감사 재; M. 달 그렌, D. Tomford,과 최상의 행정 지원에 대한 S. 나폴리탄에; 뛰어난 기술 지원 M. Dzaman에; 그리고 자이스 3D 스캐닝 전자 현미경의 구입을 향해 관대 한 지원을위한 필 F. 젠킨스에. 우리는 또한 뇌 단핵 세포의 분리를위한 밀도 원심 분리 미디어 매개 전략의 수정 된 버전이 그려진하는 하버드 의과 대학에서 Kuchroo 실험실을 인정합니다.
Dulbecco’s Modification of Eagles Medium | Gibco | 12430-054 | with 4.5g/L D-glucose, L-glutamine, 25mM HEPES and phenol red |
Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline | Gibco | 14190-144 | without calcium chloride or Magnesium chloride |
Fetal bovine serum | Omega Scientific Inc. | FB-11 | |
Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 10,000U/ml Penicillin; 10,000μg/ml Streptomycin |
L-glutamine | Gibco | 25030-081 | 200mM |
G418 sulfate | Omega Scientific Inc. | GN-04 | |
Puromycin dihydrochloride | Sigma-Aldrich | P8833 | from Streptomyces alboniger |
HyClone HyQTase non-mammalian trypsin alternative | Thermo Scientific | SV30030.01 | in DPBS with EDTA |
Phase contrast hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | 0.1mm deep |
Trypan blue stain | Gibco | 15250-061 | |
Sterile 0.9% NaCl injection, USP | Hospira | NDC: 0409-4888 | 10ml vials |
0.6ml conical polypropylenemi microtubes | Genesee Scientific | 22-272 | |
Atipamezole hydrochloride injection | Orion Pharma | NDC: 52483-6298 | 5mg/ml solution |
Ketamine hydrochloride injection | Fort Dodge | NDC: 0409-2051 | 100mg/ml solution |
Dexmedetomidine hydrochloride injection | Zoetis | NDC: 54771-2805 | 0.5mg/ml solution |
Xylazine hydrochloride injection | Lloyd | NDC: 61311-481 | 100mg/ml solution |
Carprofen injection | Pfizer | NDC: 61106-8501 | 50mg/ml solution |
Buprenorphine hydrochloride injection | Reckitt Benckiser | NDC: 12496-0757 | 0.3mg/ml ampuls |
1ml tuberculin syringes | Covidien | 8881501400 | |
26G x ½ (0.45mm x 13mm) syringe needles | BD | 305111 | |
Surgical clippers | 3M | 9661 | |
Providone-iodine solution | Aplicare | 82-217 | NDC: 52380-1905 |
Sterile petrolatum ophthalmic ointment | Dechra | NDC: 17033-211 | |
70% isopropyl alcohol prep pads | Kendall | 6818 | |
Sterile gauze | Covidien | 8044 | non-woven, 4" x 4", 4-ply |
1.7ml conical polypropylene microtubes | Genesee Scientific | 22-281 | |
Mouse stereotactic frame | Stoelting | 51730 | |
Surgical lamp | Philips Burton | CS316W | Coolspot II Variable Spotlight |
Curved dissecting forceps | Ted Pella Inc. | 5431 | |
Colibri retractors | FST | 17000-03 | |
Cordless precision power drill | Dremel | 1100-01 | Stylus model; 7.2-Volt Lithium-Ion with Docking Station |
Engraving Cutter | Dremel | 105 | 1/32" or 0.8 mm bit diameter |
Microliter syringe | Hamilton | 75 | Hamilton Microliter® Syringes 700 series; 5μl volume |
Microliter syringe needles | Hamilton | 7762-06 | 33G, small hub RN NDL, 1.5 in, point style 3, 6/PK |
Ethilon 3-0 black monofilament nylon sutures | Ethicon | 1663 | |
Magnetic stir bar | VWR | 74950-296 | 7.9mm diameter x 50mm length (5/16" diameter x 2" length) |
1L glass screw-cap storage bottle | Corning | 1395 | Type 1, Class A borosilicate glass |
Heparin sodium | Sagent | NDC: 25021-400 | 1,000U/ml solution |
Peristaltic pump | Cole Parmer Instruments Group | 77200-60 | Master Flex Easy Load II console drive |
compressed carbogen (95% O2 / 5% CO2) | available from local vendor | N/A | A-type, large cylinder |
20G x 1 ½" aluminum hub blunt needles | Kendall | 8881202363 | 0.9mm x 38.1mm |
Polyurethane ice bucket | Fisherbrand | 02-591-45 | Capacity: 0.152 oz. (4.5L) |
Collagenase (Type I-S) | Sigma Aldrich | C1639 | from Clostridium histolyticum |
Deoxyribonuclease I | Worthington Biochemical Corp. | LS002007 | >2,000 Kunitz units per mg dry weight |
Antistatic polystyrene hexagonal weighing dishes | Ted Pella Inc. | 20157-3 | top I.D. 115mm, base I.D. 85mm, 203ml volume |
Stainless steel single edged razor blades | Garvey | 40475 | |
Bone rongeurs | FST | 16001-15 | |
Hemostat | FST | 13014-14 | |
Large dissection scissors | Ted Pella Inc. | 1316 | |
Small dissection scissors | FST | 14094-11 | |
Blunt end forceps | Ted Pella Inc. | 13250 | |
7ml glass Dounce tissue grinder | Kontes | KT885300-0007 | |
Percoll Density Centrifugation Media | GE Healthcare | GE17-0891-01 | |
10 mL serological pipettes | Genesee Scientific | 12-104 | single use; sterile |
70μm sterile nylon mesh cell strainers | Fisherbrand | 22363548 | |
Alexa Fluor 700-conjugated rat anti-mouse CD45 (clone: 30-F11) | Biolegend | 103128 | |
APC-conjugated mouse anti-mouse NK1.1 (clone: PK136) | eBiosciences | 17-5941-82 | |
PE-conjugated rat anti-mouse Gr-1 (clone:RB6-8C5) | BD Pharmigen | 553128 | |
PerCP/Cy5.5-conjugated rat anti-mouse CD11b (clone: M1/70) | Biolegend | 101228 | |
Alexa Fluor 700-conjugated rat IgG2b, κ (clone: RTK4530) isotype control | Biolegend | 400628 | |
APC-conjugated mouse IgG2a, κ (clone: eBM2a) isotype control | eBioscience | 17-4724 | |
PE-conjugated rat IgG2b, κ (clone: eB149/10H5) isotype control | eBioscience | 12-4031-82 | |
PerCP/Cy5.5-conjugated rat IgG2b, κ (clone: RTK4530) isotype control | Biolegend | 400632 | |
Pacific Blue-conjugated mouse anti-mouse granzyme B (Clone: GB11) | Biolegend | 515403 | |
Pacific Blue-conjugated mouse IgG1, κ (Clone: MOPC-21) isotype control | Biolegend | 400151 | |
Cytofix/Cytoperm | BD | 554714 | |
15ml polypropylene centrifuge tubes | Genesee Scientific | 21-103 | conical bottom |
50ml polypropylene centrifuge tubes | Genesee Scientific | 21-108 | conical bottom |
12x75mm round-bottom polypropylene FACS tubes | Fisherbrand | 14-956-1B | |
FACSAria Special Order Research Product flow cytometer/cell sorter | BD | 650033 | |
Class II Biological Safety Cabinet | The Baker Company | SG603 | model: SterilGARD III Advance |