This protocol describes how to generate a Drosophila S2 cell line that is sensitive to small molecule inhibitors of kinesin-5. The use of these cells in a cell-based error correction assay is also outlined.
Kinetochores are large protein-based structures that assemble on centromeres during cell division and link chromosomes to spindle microtubules. Proper distribution of the genetic material requires that sister kinetochores on every chromosome become bioriented by attaching to microtubules from opposite spindle poles before progressing into anaphase. However, erroneous, non-bioriented attachment states are common and cellular pathways exist to both detect and correct such attachments during cell division. The process by which improper kinetochore-microtubule interactions are destabilized is referred to as error correction. To study error correction in living cells, incorrect attachments are purposely generated via chemical inhibition of kinesin-5 motor, which leads to monopolar spindle assembly, and the transition from mal-orientation to biorientation is observed following drug washout. The large number of chromosomes in many model tissue culture cell types poses a challenge in observing individual error correction events. Drosophila S2 cells are better subjects for such studies as they possess as few as 4 pairs of chromosomes. However, small molecule kinesin-5 inhibitors are ineffective against Drosophila kinesin-5 (Klp61F). Here we describe how to build a Drosophila cell line that effectively replaces Klp61F with human kinesin-5, which renders the cells sensitive to pharmacological inhibition of the motor and suitable for use in the cell-based error correction assay.
Igualdad de segregación del genoma durante la división celular requiere interacciones correctas entre el ADN y el huso microtúbulos replicados. Los microtúbulos interactuar físicamente con los cromosomas a través de un conjunto de proteínas que se reúne en centrómeros conocido como el cinetocoro 1. Distribución correcta de los cromosomas requiere que cinetocoros hermanos se biorientado, en el que cada hermana se asocia con los microtúbulos procedentes de polos del huso opuestas. Microtúbulos cinetocoro (kt-MT) archivos adjuntos que no están en la conformación biorientado se forma rápida y eficiente desestabilizó para proporcionar la oportunidad de establecer biorientación en un proceso conocido como la corrección de errores. Un ensayo de corrección de errores que se estableció previamente en células de mamífero requiere el montaje de los husillos 5 monopolares usando inhibidores de moléculas pequeñas reversibles contra Eg5 (kinesin-5). El tratamiento de la droga genera una multitud de archivos adjuntos syntelic erróneas en las que botcinetocoros h hermanas se unen al mismo polo del huso. Un lavado posterior de la droga permite la visualización del proceso de corrección de errores. El ensayo de corrección de errores se puede realizar en presencia de inhibidores de moléculas pequeñas o caídas para estudiar la contribución de las proteínas candidatas a corregir erróneas adjuntos kt-MT.
La capacidad de visualizar la corrección de errores en las células vivas es una poderosa herramienta para comprender mejor el mecanismo molecular implicado en este proceso complejo. Sin embargo, el gran número de cromosomas presentes en la mayoría de líneas celulares plantea un reto en la observación de los archivos adjuntos individuales kt-MT. Células Drosophila S2 serían ideales para aplicar el ensayo de corrección de errores, ya que contienen tan pocos como 4 cromosomas 6, pero inhibidores de molécula pequeña de kinesin 5 tales como S-tritil-L-cisteína (STLC) y monastrol 7-9 no afectan conjunto del husillo o la función motora kinesin-5 en células de Drosophila. Por lo tanto, génerosted una línea de células de Drosophila S2 expresando kinesin-5 humana bajo un promotor inducible que es sensible a los inhibidores de kinesina-5. Este protocolo se describe cómo la caída endógena Drosophila kinesin-5 homólogo, KLP61F, y el uso de esta línea celular en el ensayo de corrección de errores basado en células.
Visualización de corrección de errores es una técnica valiosa para estudiar los pasos implicados en esta importante y complejo proceso celular. Para ello, los archivos adjuntos erróneas se generan utilizando inhibidores reversibles, y corrección de errores se observa sobre lavado de la droga. Este ensayo fue desarrollado originalmente usando células de cultivo de tejidos de mamíferos 5. Sin embargo la presencia de gran número de cinetocoros en muchos tipos de células de mamíferos modelo plantea un desafío en la observación de eventos de corrección de errores individuales. Células Drosophila S2 poseen tan sólo 4 pares de cinetocoros, por lo que una línea celular más preferible para la observación de la corrección de errores. Sin embargo, un inconveniente importante es que muchos inhibidores son ineficaces en las células S2 de Drosophila. Por lo tanto, la capacidad de generar una línea celular humanizado Drosophila S2 humana que expresa kinesin-5 proporciona una valiosa herramienta para estudiar la corrección de errores.
Aunque las células S2 de Drosophila pueden ser unamejor línea de células para estudiar la corrección de errores, los múltiples pasos involucrados en la obtención de la línea celular y derribando genes esenciales plantea algunos retos para esta técnica. Por ejemplo, la eficacia de transfección puede ser muy baja. Si es menos de 20% de las células están expresando el Eg5-mCherry, la transfección se debe repetir el proceso de selección como se necesitará más tiempo. Además, el porcentaje de células que expresan ambas proteínas fluorescentes puede disminuir con el tiempo. Esto se puede superar mediante la división de las células en presencia de Blasticidin S HCl e higromicina B para seleccionar las células que expresan Eg5-mCherry y GFP-α-tubulina, respectivamente. También es importante tener en cuenta que las células S2 de Drosophila tienen orthologues a muchas proteínas humanas y; por lo tanto, es crítico para optimizar las condiciones desmontables para las proteínas endógenas. Las condiciones óptimas desmontables pueden variar en la cantidad de ARN de doble cadena y la duración del tratamiento. Teniendo en cuenta la aparición y la rápida mejora de CRISPR-Cas9 Technologies 15-17, generación de una línea celular de Drosophila con el gen KLP61F sustituido por Eg5 humana presenta una poderosa alternativa que superar las limitaciones de la transfección y el enfoque de caída. Nuestro trabajo demuestra que volar-a humano sustitución de genes debe ser una opción viable en este caso, a pesar de los reactivos necesarios para hacerlo en las células S2 de Drosophila se están desarrollando actualmente.
Este procedimiento no se limita a Eg5, pero se puede aplicar para estudiar la función de otras proteínas de interés. Si el uso de inhibidores que han sido previamente establecidos para ser ineficaz en las células S2 de Drosophila, este protocolo puede ser modificado para estudiar el efecto directo de los inhibidores en células vivas sin preocupaciones sobre los efectos de destino fuera. La línea celular producida usando este protocolo también podría utilizarse en el cribado de alto rendimiento de los análisis para identificar potenciales fármacos dirigidos a proteínas implicadas en la corrección de errores.
The authors have nothing to disclose.
Nos gustaría dar las gracias a Patricia Wadsworth por el don de la kinesin-5 construcción. Este trabajo fue apoyado por una subvención del NIH (5 R01 GM107026) a TJM y por Research Grant N º 5-FY13-205 de la Fundación March of Dimes a TJM, así como el apoyo de la Fundación Charles H. Hood, Inc., Boston, MA. a TJM
Effectine Transfection Reagent | Qiagen | 301425 | |
Klp61F cDNA | Drosophila Genomic Resource Center | 13690 | Gene Name LD15641 |
Schneider’s Media | Invitrogen | 21720-024 | |
Fetal Bovine Serum, certified | Invitrogen | 10082-147 | Heat Inactivated, US origin |
Copper (II) Sulfate (CuSO4) | Sigma | C8027-500G | 500mM stock |
S-trityl-l-cysteine | Sigma | 164739-5G | 1mM stock in DMSO |
Blasticidin HCl | Invitrogen | R21001 | 5mg/ml stock in 1x PBS |
Hygromycin B | Invitrogen | 10687010 | |
T7 Large scale RNA Production System | Promega | P1320 | The approximate dsRNA concentration from each reaction is about 5-15µg/µl |
Klp61F RNAi F primer | Invitrogen | TAATACGACTCACTATAGGGTA-TTTGCGCATTATTTTAAAA | |
Klp61F RNAi R primer | Invitrogen | TAATACGACTCACTATAGGGAT-ATTGATCAATTGAAAC | |
PCR clean-up kit | Mo Bio Laboratories, Inc | 1250 | |
Concanavalin A | Sigma | C5275 | 0.5mg/ml solution made by dissolving in 1xPBS. |
Boiled Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch Labs | 017-000-121 | 5% stock solution in 1X PHEM buffer, bring solution up to boil. Stored in 4°C. |
Mounting Media | 20mM Tris pH 8.0, 0.5% N-propyl gallate, 90% Glycerol. Stored in 4°C | ||
1x BRB-80 | 80 mM PIPES pH 6.9; 1 mM EGTA; 1 mM MgCl2 | ||
White Light Source | Lumencor Inc | ||
ET EGFP Filter Cube | Chroma | 49002 | |
DSRed Filter Cube | Chroma | 49005 | |
anti-NDC80 antibody | Custom made by the Maresca Lab | ||
DM1α (anti-α-tubulin) | Sigma | T6199 | |
anti-CID antibody | AbCam | ab10887 |