This protocol describes how to generate a Drosophila S2 cell line that is sensitive to small molecule inhibitors of kinesin-5. The use of these cells in a cell-based error correction assay is also outlined.
Kinetochores are large protein-based structures that assemble on centromeres during cell division and link chromosomes to spindle microtubules. Proper distribution of the genetic material requires that sister kinetochores on every chromosome become bioriented by attaching to microtubules from opposite spindle poles before progressing into anaphase. However, erroneous, non-bioriented attachment states are common and cellular pathways exist to both detect and correct such attachments during cell division. The process by which improper kinetochore-microtubule interactions are destabilized is referred to as error correction. To study error correction in living cells, incorrect attachments are purposely generated via chemical inhibition of kinesin-5 motor, which leads to monopolar spindle assembly, and the transition from mal-orientation to biorientation is observed following drug washout. The large number of chromosomes in many model tissue culture cell types poses a challenge in observing individual error correction events. Drosophila S2 cells are better subjects for such studies as they possess as few as 4 pairs of chromosomes. However, small molecule kinesin-5 inhibitors are ineffective against Drosophila kinesin-5 (Klp61F). Here we describe how to build a Drosophila cell line that effectively replaces Klp61F with human kinesin-5, which renders the cells sensitive to pharmacological inhibition of the motor and suitable for use in the cell-based error correction assay.
Равное разделение генома во время деления клетки требует правильных взаимодействий между ДНК и репликации микротрубочек веретена. Микротрубочки физически взаимодействовать с хромосомами через ансамбль белков, которые собирает в центромерах известных как кинетохорах 1. Правильное распределение хромосом требует сестра кинетохоры которые с двойной ориентацией, в которой каждый сестра связано с микротрубочками, происходящих из противоположных полюсов шпинделя. Кинетохор микротрубочек (кт-МТ) вложения, которые не в двойной ориентацией конформации быстро и эффективно дестабилизирована, чтобы обеспечить возможность установить biorientation в процессе, известном как исправление ошибок. Исправление ошибок анализа, который ранее был создан в клетках млекопитающих 5 требует сборки монополярных шпинделей с помощью обратимых низкомолекулярные ингибиторы против EG5 (кинезин-5). Лечение наркотиками порождает множество ошибочных syntelic вложений, в котором ботч сестра кинетохоры приложить к тому же полюса веретена. Последующее смыв препарата позволяет визуализации процесса коррекции ошибок. Исправление ошибок анализ может быть сделано в присутствии низкомолекулярные ингибиторы или нокдаун для изучения вклада кандидатов белков к исправлению ошибочных вложения кт-МТ.
Возможность визуализировать исправление ошибок в живых клетках является мощным инструментом для дальнейшего понимания молекулярного механизма, участвующих в этом сложном процессе. Тем не менее, большое количество хромосом, присутствующих в большинстве клеточных линий представляет собой вызов в наблюдении отдельных вложения кт-MT. Дрозофилы S2 клетки будут идеально подходит для применения коррекции ошибок анализа, поскольку они содержат всего лишь как 4 хромосомы 6, но низкомолекулярные ингибиторы кинезин 5, такие как S-тритил-L-цистеина (STLC) и monastrol 7-9 не влияет шпинделя в сборе или кинезин-5 моторную функцию в клетках дрозофилы. Поэтому мы родыТед клеточная линия дрозофилы S2 выражения человеческого кинезин-5 под индуцируемого промотора, чувствительного к кинезин-5 ингибиторов. Этот протокол описывает, как нокдаун эндогенной дрозофилы кинезин-5 гомолог, Klp61F, и использовать эту линию клеток в клеточной основе коррекции ошибок анализа.
Визуализация коррекции ошибок является ценным методика исследования этапы в этом важном и сложном процессе клеточного. Чтобы сделать это, ошибочные вложения генерируется с использованием обратимыми ингибиторами, и исправление ошибок наблюдается при вымывания препарата. Этот анализ был первоначально разработан с использованием ткани млекопитающего культуры клеток 5. Однако наличие большого числа кинетохорами во многих модельных типов клеток млекопитающих представляет собой вызов в наблюдении отдельных событий коррекции ошибок. Дрозофилы S2 клетки обладают, как мало, как 4 пары кинетохорами, что делает их более предпочтительным клеточную линию для наблюдения коррекции ошибок. Однако основным недостатком является то, что многие ингибиторы неэффективны в Drosophila S2 клетках. Таким образом, способность генерировать гуманизированного клеточную линию клетки Drosophila S2, экспрессирующих человеческий кинезин-5 представляет собой ценный инструмент для изучения коррекции ошибок.
Хотя дрозофилы S2 клетки могут бытьлучше клеточной линии для изучения коррекции ошибок, несколько шагов, участвующих в получении клеточной линии и сбить существенные гены создает некоторые проблемы в этой технике. Например, эффективность трансфекции может быть достаточно низким. Если менее 20% клеток выражают EG5-mCherry, трансфекции следует повторить, как процесс отбора будет длиться дольше. Кроме того, процент клеток, экспрессирующих обе флуоресцентные белки могут уменьшаться с течением времени. Эту проблему можно решить путем разделения клеток в присутствии бластицидин S HCl и гигромицина, чтобы выбрать для клеток, экспрессирующих EG5-mCherry и GFP-альфа-тубулина, соответственно. Важно также отметить, что дрозофилы S2 клетки имеют ортологи на многие белки человека и, Поэтому, важно, чтобы оптимизировать нокдауна условия для эндогенных белков. Оптимальные условия могут варьироваться нокдаун в размере дцРНК и продолжительности лечения. Учитывая появление и быстрое улучшение CRISPR-Cas9 TECHNOLOGIES 15-17, генерация клеточной линии Drosophila с геном Klp61F заменен человека EG5 представляет мощную альтернативу, которая бы преодолеть ограничения трансфекции и бросовой подхода. Наша работа показывает, что муха к человеку замены гена должны быть жизнеспособным вариантом в этом случае, хотя необходимые реагенты, чтобы сделать это в дрозофилы S2 клеток в настоящее время разрабатываются.
Эта процедура не ограничивается EG5, но могут быть применены для изучения функции других белков, представляющих интерес. При использовании ингибиторов, которые ранее были установлены, чтобы быть неэффективным в дрозофилы S2 клеток, этот протокол может быть изменен, чтобы изучить прямое действие ингибиторов в живых клетках без озабоченности мимо ворот эффектов. Клеточная линия, полученные с использованием этого протокола, также могут быть использованы в высокопроизводительного скрининга анализа для идентификации потенциальных лекарств, направленные белки, участвующие в коррекции ошибок.
The authors have nothing to disclose.
Мы хотели бы поблагодарить Патрицию Уодсворт за дар от кинезин-5 конструкции. Эта работа была поддержана грантом NIH в (5 R01 GM107026) для TJM и научно-исследовательский грант № 5-FY13-205 от марта Dimes фонд в TJM, а также поддержки со стороны Чарльза Х. Гуд Foundation, Inc., Бостон, Массачусетс. чтобы TJM
Effectine Transfection Reagent | Qiagen | 301425 | |
Klp61F cDNA | Drosophila Genomic Resource Center | 13690 | Gene Name LD15641 |
Schneider’s Media | Invitrogen | 21720-024 | |
Fetal Bovine Serum, certified | Invitrogen | 10082-147 | Heat Inactivated, US origin |
Copper (II) Sulfate (CuSO4) | Sigma | C8027-500G | 500mM stock |
S-trityl-l-cysteine | Sigma | 164739-5G | 1mM stock in DMSO |
Blasticidin HCl | Invitrogen | R21001 | 5mg/ml stock in 1x PBS |
Hygromycin B | Invitrogen | 10687010 | |
T7 Large scale RNA Production System | Promega | P1320 | The approximate dsRNA concentration from each reaction is about 5-15µg/µl |
Klp61F RNAi F primer | Invitrogen | TAATACGACTCACTATAGGGTA-TTTGCGCATTATTTTAAAA | |
Klp61F RNAi R primer | Invitrogen | TAATACGACTCACTATAGGGAT-ATTGATCAATTGAAAC | |
PCR clean-up kit | Mo Bio Laboratories, Inc | 1250 | |
Concanavalin A | Sigma | C5275 | 0.5mg/ml solution made by dissolving in 1xPBS. |
Boiled Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch Labs | 017-000-121 | 5% stock solution in 1X PHEM buffer, bring solution up to boil. Stored in 4°C. |
Mounting Media | 20mM Tris pH 8.0, 0.5% N-propyl gallate, 90% Glycerol. Stored in 4°C | ||
1x BRB-80 | 80 mM PIPES pH 6.9; 1 mM EGTA; 1 mM MgCl2 | ||
White Light Source | Lumencor Inc | ||
ET EGFP Filter Cube | Chroma | 49002 | |
DSRed Filter Cube | Chroma | 49005 | |
anti-NDC80 antibody | Custom made by the Maresca Lab | ||
DM1α (anti-α-tubulin) | Sigma | T6199 | |
anti-CID antibody | AbCam | ab10887 |