This protocol describes how to generate a Drosophila S2 cell line that is sensitive to small molecule inhibitors of kinesin-5. The use of these cells in a cell-based error correction assay is also outlined.
Kinetochores are large protein-based structures that assemble on centromeres during cell division and link chromosomes to spindle microtubules. Proper distribution of the genetic material requires that sister kinetochores on every chromosome become bioriented by attaching to microtubules from opposite spindle poles before progressing into anaphase. However, erroneous, non-bioriented attachment states are common and cellular pathways exist to both detect and correct such attachments during cell division. The process by which improper kinetochore-microtubule interactions are destabilized is referred to as error correction. To study error correction in living cells, incorrect attachments are purposely generated via chemical inhibition of kinesin-5 motor, which leads to monopolar spindle assembly, and the transition from mal-orientation to biorientation is observed following drug washout. The large number of chromosomes in many model tissue culture cell types poses a challenge in observing individual error correction events. Drosophila S2 cells are better subjects for such studies as they possess as few as 4 pairs of chromosomes. However, small molecule kinesin-5 inhibitors are ineffective against Drosophila kinesin-5 (Klp61F). Here we describe how to build a Drosophila cell line that effectively replaces Klp61F with human kinesin-5, which renders the cells sensitive to pharmacological inhibition of the motor and suitable for use in the cell-based error correction assay.
Uguale la segregazione del genoma durante la divisione cellulare richiede corrette interazioni tra il DNA e mandrino microtubuli replicati. I microtubuli interagiscono fisicamente con cromosomi attraverso un insieme di proteine che si raduna a centromeri conosciuto come il cinetocore 1. Corretta distribuzione dei cromosomi che richiede cinetocori sorella sono biorientato, in cui ogni sorella è associata microtubuli provenienti da opposti poli del fuso. Cinetocore microtubuli (KT-MT) gli allegati che non sono nella conformazione biorientato stanno rapidamente ed efficientemente destabilizzata per fornire l'opportunità di stabilire biorientazione in un processo noto come la correzione degli errori. Un saggio di correzione di errore che è stato precedentemente stabilito in cellule di mammifero 5 richiede il montaggio mandrini monopolare utilizzando inibitori molecolari reversibili piccoli contro Eg5 (kinesin-5). Il trattamento farmacologico genera una moltitudine di accessori syntelic erronee in cui botcinetocori h sorella attribuiscono alla stesso polo del mandrino. Una successiva washout del farmaco permette la visualizzazione del processo di correzione degli errori. Il dosaggio di correzione di errore può essere effettuata in presenza di piccole molecole inibitrici o abbattimenti di studiare il contributo delle proteine candidate per correggere errati allegati kt-MT.
La possibilità di visualizzare la correzione degli errori nelle cellule viventi è un potente strumento per capire meglio il meccanismo molecolare coinvolto in questo processo complesso. Tuttavia, il numero di cromosomi presenti nella maggior parte delle linee cellulari rappresenta una sfida nell'osservare singoli allegati kt-MT. Cellule di Drosophila S2 sarebbe ideale per applicare il saggio correzione di errore in quanto contengono come pochi come 4 cromosomi 6, ma piccole molecole inibitrici di kinesin 5 come S-tritil-L-cisteina (STLC) e monastrol 7-9 non influenzano l'assemblaggio del fuso o la funzione kinesin-5 motore in cellule di Drosophila. Pertanto generita una linea cellulare che esprime Drosophila S2 chinesina-5 umana sotto un promotore inducibile che è sensibile alla chinesina-5 inibitori. Questo protocollo descrive come knockdown endogeno Drosophila kinesin-5 omologo, Klp61F, e utilizzare questa linea cellulare nel dosaggio di correzione degli errori cell-based.
Visualizzare la correzione degli errori è una tecnica preziosa per studiare le fasi di questo processo cellulare importante e complesso. Per farlo, gli allegati erronei vengono generati utilizzando inibitori reversibili, e la correzione degli errori, si osserva su washout del farmaco. Questo test è stato originariamente sviluppato utilizzando cellule di coltura dei tessuti dei mammiferi 5. Tuttavia la presenza di un gran numero di cinetocori in molti tipi di cellule di mammifero modello rappresenta una sfida nell'osservare singoli eventi di correzione di errore. Cellule di Drosophila S2 possiedono come pochi come 4 paia di cinetocori, rendendoli una linea cellulare più preferibile per osservare la correzione degli errori. Tuttavia, un grave inconveniente è che molti inibitori sono inefficaci in cellule di Drosophila S2. Così, la capacità di generare una linea di cellule di Drosophila S2 umanizzato esprimendo umana kinesin-5 offre un valido strumento per studiare la correzione degli errori.
Sebbene le cellule di Drosophila S2 possono esseremeglio linea cellulare di studiare la correzione degli errori, i diversi passaggi necessari per ottenere la linea cellulare e abbattendo geni essenziali pone alcune sfide a questa tecnica. Per esempio, l'efficienza di trasfezione può essere molto bassa. Se meno del 20% delle cellule sono esprimendo il Eg5-mCherry, la trasfezione deve essere ripetuto il processo di selezione richiederà più. Inoltre, la percentuale di cellule che esprimono proteine fluorescenti entrambi può diminuire nel tempo. Questo può essere superata suddividendo cellule in presenza di HCl Blasticidin S e Hygromycin B per selezionare cellule esprimenti Eg5-mCherry e GFP-α-tubulina, rispettivamente. E 'anche importante notare che le cellule di Drosophila S2 hanno ortologhi a molte proteine umane e; Pertanto, è fondamentale per ottimizzare le condizioni smontabili per le proteine endogene. Condizioni ottimali possono variare abbattibili nella quantità di dsRNA e la durata del trattamento. Considerando la nascita e rapido miglioramento di CRISPR-Cas9 technologies 15-17, generazione di una linea di cellule di Drosophila con il gene Klp61F sostituito da Eg5 umana presenta una potente alternativa che superare i limiti della trasfezione e approccio knockdown. Il nostro lavoro dimostra che volare a uomo sostituzione del gene dovrebbe essere una valida opzione in questo caso, anche se i reagenti necessari per farlo in cellule di Drosophila S2 sono attualmente in fase di sviluppo.
Questa procedura non è limitato a Eg5, ma può essere applicato per studiare la funzione di altre proteine di interesse. Se si utilizza inibitori che sono stati stabiliti in precedenza per essere inefficace in cellule di Drosophila S2, questo protocollo può essere modificato per studiare l'effetto diretto degli inibitori in cellule vive senza preoccupazioni circa gli effetti di destinazione off. La linea cellulare prodotta usando questo protocollo potrebbe essere utilizzato anche in screening ad alto rendimento analisi per identificare potenziali farmaci destinati proteine coinvolte nella correzione degli errori.
The authors have nothing to disclose.
Vorremmo ringraziare Patricia Wadsworth per il dono della kinesin-5 costrutto. Questo lavoro è stato finanziato da una sovvenzione del NIH (5 R01 GM107026) a TJM e Research Grant n ° 5-FY13-205 dal marzo di Dimes Fondazione TJM, così come il sostegno della Charles H. Hood Foundation, Inc., Boston, MA. a TJM
Effectine Transfection Reagent | Qiagen | 301425 | |
Klp61F cDNA | Drosophila Genomic Resource Center | 13690 | Gene Name LD15641 |
Schneider’s Media | Invitrogen | 21720-024 | |
Fetal Bovine Serum, certified | Invitrogen | 10082-147 | Heat Inactivated, US origin |
Copper (II) Sulfate (CuSO4) | Sigma | C8027-500G | 500mM stock |
S-trityl-l-cysteine | Sigma | 164739-5G | 1mM stock in DMSO |
Blasticidin HCl | Invitrogen | R21001 | 5mg/ml stock in 1x PBS |
Hygromycin B | Invitrogen | 10687010 | |
T7 Large scale RNA Production System | Promega | P1320 | The approximate dsRNA concentration from each reaction is about 5-15µg/µl |
Klp61F RNAi F primer | Invitrogen | TAATACGACTCACTATAGGGTA-TTTGCGCATTATTTTAAAA | |
Klp61F RNAi R primer | Invitrogen | TAATACGACTCACTATAGGGAT-ATTGATCAATTGAAAC | |
PCR clean-up kit | Mo Bio Laboratories, Inc | 1250 | |
Concanavalin A | Sigma | C5275 | 0.5mg/ml solution made by dissolving in 1xPBS. |
Boiled Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch Labs | 017-000-121 | 5% stock solution in 1X PHEM buffer, bring solution up to boil. Stored in 4°C. |
Mounting Media | 20mM Tris pH 8.0, 0.5% N-propyl gallate, 90% Glycerol. Stored in 4°C | ||
1x BRB-80 | 80 mM PIPES pH 6.9; 1 mM EGTA; 1 mM MgCl2 | ||
White Light Source | Lumencor Inc | ||
ET EGFP Filter Cube | Chroma | 49002 | |
DSRed Filter Cube | Chroma | 49005 | |
anti-NDC80 antibody | Custom made by the Maresca Lab | ||
DM1α (anti-α-tubulin) | Sigma | T6199 | |
anti-CID antibody | AbCam | ab10887 |