El aislamiento físico de endosporas de muestras ambientales por Targeted lisis de las células vegetativas
Summary
A method to single out bacterial endospores from complex microbial communities was developed to perform tailored culture or molecular studies of this group of bacteria.
Abstract
Endospore formation is a survival strategy found among some bacteria from the phylum Firmicutes. During endospore formation, these bacteria enter a morpho-physiological resting state that enhances survival under adverse environmental conditions. Even though endospore-forming Firmicutes are one of the most frequently enriched and isolated bacterial groups in culturing studies, they are often absent from diversity studies based on molecular methods. The resistance of the spore core is considered one of the factors limiting the recovery of DNA from endospores. We developed a method that takes advantage of the higher resistance of endospores to separate them from other cells in a complex microbial community using physical, enzymatic and chemical lysis methods. The endospore-only preparation thus obtained can be used for re-culturing or to perform downstream analysis such as tailored DNA extraction optimized for endospores and subsequent DNA sequencing. This method, applied to sediment samples, has allowed the enrichment of endospores and after sequencing, has revealed a large diversity of endospore-formers in freshwater lake sediments. We expect that the application of this method to other samples will yield a similar outcome.
Introduction
El objetivo de este trabajo es proporcionar un protocolo para la separación de las endosporas bacterianas a partir de células bacterianas vegetativas en muestras ambientales. La formación de endosporas bacterianas es una estrategia de supervivencia, por lo general desencadenada por la inanición, que se encuentra en una serie de grupos de bacterias pertenecientes a la phylum Firmicutes 1. Bacterias que forman endosporas están bien estudiados, principalmente debido a que un número de cepas son patógenos y, por tanto, de importancia médica (por ejemplo, Bacillus anthracis o Clostridium difficile). Cepas ambientales de bacterias formadoras de endosporas se han aislado de prácticamente cualquier entorno (suelo, agua, los sedimentos, el aire, hielo, intestino humano, animales intestino, y más) 1-3. Por lo tanto, Firmicutes son el segundo phylum más abundante en las colecciones de cultivos 4.
Debido a sus proteínas de la corteza externa y el núcleo de protección resistentes, endosporas pueden sobrevivir en condiciones ambientales extremas que van from desecación de alta radiación, temperaturas extremas y sustancias químicas nocivas 5. Este notable resistencia hace que sea un reto para extraer el ADN de las endosporas 6-8. Esto probablemente explica por qué se les ha pasado por alto en los estudios de secuenciación del medio ambiente 9,10. Otros métodos, tales como la orientación de endosporas en muestras ambientales por anticuerpos fluorescentes 11, la cuantificación de ácido dipicolínico (DPA) en el suelo 12 y el sedimento 13, citometría de flujo 14 o pasteurización y posterior cultivo de 15,16 se han utilizado para recuperar o cuantificar en endosporas muestras ambientales. En los últimos años, los métodos de extracción de ADN optimizada, así como cebadores moleculares específicos a secuencias diana de genes-endosporas específica se han desarrollado 10,17-20. Esto ha ayudado a revelar más biodiversidad en este grupo de bacterias 21 y también ha dado lugar a aplicaciones en la industria y la medicina para la detección de endosporas, Por ejemplo en la leche en polvo 19.
El protocolo que aquí se presenta se basa en la diferencia de resistencia a las condiciones físico-químicas nocivas (como el calor y detergentes) de endosporas bacterianas en relación con las células vegetativas. Para destruir las células vegetativas en una muestra, que consecutivamente aplicar calor, lisozima y bajas concentraciones de detergentes. El tiempo y la fuerza de estos tratamientos han sido optimizados a fin de no destruir las esporas, pero para lisar todas las células vegetativas. Algunas células en una piscina de células del medio ambiente son más resistentes que otros, por lo que con el fin de aumentar la probabilidad de destruir todas las células vegetativas, se aplican tres tratamientos diferentes. La ventaja y novedad de este método es que las endosporas después del tratamiento están todavía intactos y pueden ser utilizados para otros análisis aguas abajo. Estos incluyen la extracción de ADN, PCR cuantitativa (qPCR) y amplificación o secuenciación metagenómica (dirigido específicamente al grupo de endosporas y por lo tanto la reducción dIVERSIDAD, al tiempo que aumenta la cobertura). Las endosporas también podrían utilizarse para el cultivo de aguas abajo o cuantificación por microscopía de fluorescencia, citometría de flujo, o detección de DPA. Una característica importante de este método es que mediante la comparación de una muestra no tratada con una muestra tratada, se puede deducir la cantidad y diversidad de endosporas en una muestra ambiental, además de la componente correspondiente a las células vegetativas.
Protocol
Representative Results
Discussion
La resistencia de endosporas a factores fisicoquímicos agresivas externas (por ejemplo, la temperatura o detergentes) se utilizó para diseñar un método para separar las endosporas bacterianas de células vegetativas en muestras ambientales. Esta es la primera método integral para aislar endosporas a partir de muestras ambientales de una manera no destructiva. Los métodos anteriores para cuantificar, detectar o analizar endosporas en las muestras se basan en la medición de los proxies específico…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a la Fundación Nacional de Ciencia de Suiza para la Subvención No. 31003A-132358/1, 31003A_152972 y No. 151 948, y la Fundación Pierre Mercier pour la Ciencia.
Materials
| Whatman nitrocellulose membrane filters, 0,2 um pore size, 47 mm diameter | Sigma-Aldrich | WHA7182004 Aldrich | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Aldrich | 252859 Sigma-Aldrich | CAS 77-86-1 |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 Sigma-Aldrich | CAS 60-00-4 |
| Lysozyme from chicken egg white | Sigma-Aldrich | 62971 Fluka | powder, CAS 12650-88-3 |
| Ultra-Turrax homogenizer T18 basic | IKA | 3720000 | |
| Glass filter holders for 47 mm membranes, pyrex glass | EMD Millipore | XX10 047 00 | |
| Chemical duty vacuum pump | Millipore | WP6122050 | 220 V/50 Hz |
| Manifold sampling filtration for 25 mm membranes | Millipore | 1225 Sampling Manifold | polypropylene |
| Dnase | New England Biolabs | M0303S | Rnase free |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881 Sigma-Aldrich | CAS 1310-73-2 |
| Sodium dodecyl sulfphate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 Sigma | |
| Whatman nitrocellulose membrane filters, 0,2 um pore size, 25 mm diameter | Sigma-Aldrich | WHA7182002 Aldrich | |
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