식물 세포의 표적으로 용해하여 환경 시료에서 내생 포자의 물리적 분리
Summary
A method to single out bacterial endospores from complex microbial communities was developed to perform tailored culture or molecular studies of this group of bacteria.
Abstract
Endospore formation is a survival strategy found among some bacteria from the phylum Firmicutes. During endospore formation, these bacteria enter a morpho-physiological resting state that enhances survival under adverse environmental conditions. Even though endospore-forming Firmicutes are one of the most frequently enriched and isolated bacterial groups in culturing studies, they are often absent from diversity studies based on molecular methods. The resistance of the spore core is considered one of the factors limiting the recovery of DNA from endospores. We developed a method that takes advantage of the higher resistance of endospores to separate them from other cells in a complex microbial community using physical, enzymatic and chemical lysis methods. The endospore-only preparation thus obtained can be used for re-culturing or to perform downstream analysis such as tailored DNA extraction optimized for endospores and subsequent DNA sequencing. This method, applied to sediment samples, has allowed the enrichment of endospores and after sequencing, has revealed a large diversity of endospore-formers in freshwater lake sediments. We expect that the application of this method to other samples will yield a similar outcome.
Introduction
이 연구의 목적은 환경 시료에서 식물 세균 세포에서 세균 내생 포자의 분리를위한 프로토콜을 제공하는 것이다. 박테리아 내생 포자의 형성은 문 후벽 균 1 그룹에 속하는 박테리아의 수에서 발견 생존 전략, 보통 기아에 의해 유발된다. 내생 포자 형성 세균이 잘 균주의 수는 병원균 따라서 의료의 중요성 (예를 들어, 탄저균이나 클로스 트리 디움 디피)의 주로하기 때문에, 연구한다. 내생 포자 형성 박테리아의 환경 균주는 거의 모든 환경 (토양, 물, 퇴적물, 공기, 얼음, 인간의 직감, 동물의 창자 등) 1-3에서 고립되었다. 따라서, 후벽 균 배양 컬렉션 (4)에서 두 번째로 가장 풍부한 문이다.
때문에 튼튼한 외부 피질 및 보호 핵심 단백질, 내생 포자는 FR에 이르기까지 극단적 인 환경 조건을 견딜 수높은 방사선, 극한의 온도 및 유해 화학 물질 5 옴 탈수. 이 놀라운 저항은 내생 포자 6-8에서 DNA를 추출하는 도전한다. 그들은 환경 시퀀싱 연구 9,10에서 간과 된 이유는 가능성을 설명합니다. 형광 항체 (11)에 의해 환경 시료의 내생 포자의 대상과 같은 다른 방법, 토양 12, 퇴적물 13 dipicolinic 산의 정량 (DPA)은 14 유동 세포 계측법 또는 저온 살균 이후 재배 (15, 16)는에 내생 포자를 검색하거나 정량화하는데 사용되어왔다 환경 시료. 최근, 최적화 된 DNA 추출 방법뿐만 아니라, 특정 분자 프라이머 내생 포자 특정 유전자 서열은 10,17-20 개발 된 타겟팅한다. 이 박테리아 (21)이 그룹들 사이에서 더 많은 생물 다양성을 나타 내기 위해 도움이 또한 내생 포자의 검출을위한 산업 및 의학에 응용하게되었다, 우유 분말 (19)의 예를 들어.
여기에 제시된 프로토콜은 식물 세포에 대하여 내생 포자의 세균 (예 : 열 및 세제 등) 유해한 물리 화학적 조건에 저항의 차이에 기초한다. 샘플에서 식물 세포를 파괴하기 위해, 우리는 연속적으로 열, 리소자임과 세제의 낮은 농도를 적용합니다. 포자를 파괴하지만, 모든 식물 세포를 용균하지 않도록 이러한 치료의 시간과 강도를 최적화되었다. 환경 세포 풀의 일부 셀들은 다른 것보다 더 내성이므로, 모든 식물 세포 파괴의 확률을 증가시키기 위해, 우리는 세 가지 다른 치료를 적용한다. 이 방법의 장점 및 신규성은 치료 후 내생 포자는 그대로이며, 하류의 분석에 이용 될 수 있다는 것이다. 이들은 D를 감소 따라서 DNA 추출, 정량 PCR (qPCR에) 및 앰플 리콘 또는 특히 내생 포자의 그룹을 대상으로 metagenomic 시퀀싱 (및 포함iversity) 범위 증가한다. 또한 하류 내생 포자 배양 또는 형광 현미경으로 정량에 사용될 수있는, 유동 세포 계측법, 또는 DPA의 검출. 이 방법의 중요한 특징은 처리 된 샘플과 미처리 샘플과 비교하여, 하나의 셀에 대응하는 식물 성분 외에 환경 샘플에서 내생 포자의 양과 다양성을 추론 할 수 있다는 점이다.
Protocol
Representative Results
Discussion
외부 공격적인 물리 화학적 요인 (예를 들면, 온도 또는 세제)에 내생 포자의 저항은 환경 시료에서 식물 세포에서 세균 내생 포자를 분리하는 방법을 고안 하였다. 이것은 비파괴 방식으로 환경 시료로부터 내생 포자를 분리하는 제 광범위한 방법이다. , 양을 감지하거나 샘플 내생 포자를 분석하는 이전 방법 등 dipicolinic 산 또는 특정 마커 유전자와 같은 내생 포자에 대한 특정 프록시의 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 그랜트 번호 31003A-1분의 132,358, 31003A_152972 및 번호 151948에 대한 스위스 국립 과학 재단 (National Science Foundation)을 인정하고 Fundation 피에르 메르 라 과학을 붓는다.
Materials
| Whatman nitrocellulose membrane filters, 0,2 um pore size, 47 mm diameter | Sigma-Aldrich | WHA7182004 Aldrich | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Aldrich | 252859 Sigma-Aldrich | CAS 77-86-1 |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 Sigma-Aldrich | CAS 60-00-4 |
| Lysozyme from chicken egg white | Sigma-Aldrich | 62971 Fluka | powder, CAS 12650-88-3 |
| Ultra-Turrax homogenizer T18 basic | IKA | 3720000 | |
| Glass filter holders for 47 mm membranes, pyrex glass | EMD Millipore | XX10 047 00 | |
| Chemical duty vacuum pump | Millipore | WP6122050 | 220 V/50 Hz |
| Manifold sampling filtration for 25 mm membranes | Millipore | 1225 Sampling Manifold | polypropylene |
| Dnase | New England Biolabs | M0303S | Rnase free |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881 Sigma-Aldrich | CAS 1310-73-2 |
| Sodium dodecyl sulfphate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 Sigma | |
| Whatman nitrocellulose membrane filters, 0,2 um pore size, 25 mm diameter | Sigma-Aldrich | WHA7182002 Aldrich | |
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