A method to single out bacterial endospores from complex microbial communities was developed to perform tailored culture or molecular studies of this group of bacteria.
Endospore formation is a survival strategy found among some bacteria from the phylum Firmicutes. During endospore formation, these bacteria enter a morpho-physiological resting state that enhances survival under adverse environmental conditions. Even though endospore-forming Firmicutes are one of the most frequently enriched and isolated bacterial groups in culturing studies, they are often absent from diversity studies based on molecular methods. The resistance of the spore core is considered one of the factors limiting the recovery of DNA from endospores. We developed a method that takes advantage of the higher resistance of endospores to separate them from other cells in a complex microbial community using physical, enzymatic and chemical lysis methods. The endospore-only preparation thus obtained can be used for re-culturing or to perform downstream analysis such as tailored DNA extraction optimized for endospores and subsequent DNA sequencing. This method, applied to sediment samples, has allowed the enrichment of endospores and after sequencing, has revealed a large diversity of endospore-formers in freshwater lake sediments. We expect that the application of this method to other samples will yield a similar outcome.
Het doel van dit werk is om een protocol voor de scheiding van bacteriële endosporen van vegetatieve bacteriële cellen in het milieu monsters. De vorming van bacteriële endosporen een overlevingsstrategie, gewoonlijk veroorzaakt door verhongering gevonden in een aantal bacteriële groepen die tot phylum Firmicutes 1. Endospore-vormende bacteriën zijn goed bestudeerd, vooral omdat een aantal stammen zijn ziekteverwekkers en dus van medisch belang (bijvoorbeeld Bacillus anthracis of Clostridium difficile). Milieu stammen van endospore-vormende bacteriën zijn geïsoleerd uit vrijwel elke omgeving (bodem, water, sedimenten, lucht, ijs, menselijke darm, dieren gut, en meer) 1-3. Daarom Firmicutes zijn de tweede meest voorkomende stam in cultuur collecties 4.
Door hun sterke buitenste cortex en beschermende kern eiwitten, kan endospores extreme omstandigheden, variërend fr overlevenOM verdroging te hoge straling, extreme temperaturen en schadelijke chemische stoffen 5. Deze opmerkelijke weerstand maakt het een uitdaging om DNA uit endospores 6-8 halen. Dit verklaart waarschijnlijk waarom ze zijn over het hoofd gezien in het milieu sequencing studies 9,10. Andere methoden, zoals de concentratie van endospores milieumonsters door fluorescente antilichamen 11, kwantificatie van dipicolinezuur (DPA) in grond en sediment 13 12 flowcytometrie 14 of pasteurisatie en daaropvolgende kweek 15,16 zijn gebruikt om endosporen halen of kwantificeren milieu monsters. In de afgelopen jaren, geoptimaliseerde DNA-extractie werkwijzen en specifieke moleculaire primers te richten endospore-specifieke gensequenties ontwikkeld 10,17-20. Dit heeft bijgedragen aan meer biodiversiteit onder deze groep van bacteriën 21 onthullen en heeft ook geleid tot toepassingen in de industrie en de geneeskunde voor de detectie van endosporesBijvoorbeeld in melkpoeder 19.
De hier gepresenteerde protocol is gebaseerd op het verschil in weerstand tegen schadelijke fysisch-chemische omstandigheden (zoals warmte en detergenten) van bacteriële endosporen opzichte van vegetatieve cellen. Om vegetatieve cellen in een monster te vernietigen, we achtereenvolgens toepassen warmte, lysozym en lage concentraties van detergenten. De tijd en de sterkte van deze behandelingen zijn geoptimaliseerd om geen sporen te vernietigen, maar voor alle vegetatieve cellen lyseren. Sommige cellen in een milieu celpool meer resistent dan andere, dus om de kans op het vernietigen van alle vegetatieve cellen verhogen we drie behandelingen toegepast. Het voordelig nieuwheid van deze werkwijze is dat de endosporen na de behandeling nog steeds intact en kan worden gebruikt voor verdere stroomafwaartse analyses. Deze omvatten DNA-extractie, kwantitatieve PCR (qPCR) en amplicon of metagenomic sequencing (gericht op met name de groep van endospores en dus het verminderen van diversity, terwijl het verhogen van de dekking). De endosporen kan ook worden gebruikt voor stroomafwaartse cultuur- of kwantificatie met behulp van fluorescentie microscopie, flow cytometrie, of detectie van DPA. Een belangrijk kenmerk van deze methode is dat door een onbehandeld monster met een behandeld monster, kan men de hoeveelheid en de diversiteit van endosporen afleiden in een milieumonster naast de component die overeenkomt met vegetatieve cellen.
De weerstand van endosporen externe agressieve fysisch-chemische factoren (bijvoorbeeld temperatuur of detergenten) werd gebruikt om een methode om bacteriële endosporen scheiden van vegetatieve cellen milieumonsters bedenken. Dit is de eerste uitgebreide methode endosporen van milieumonsters te isoleren op een niet-destructieve wijze. Vorige methoden te kwantificeren, sporen of endospores in monsters te analyseren gebaseerd op de meting van specifieke proxies voor endosporen zoals dipicolinezuur of specifieke…
The authors have nothing to disclose.
De auteurs erkennen de Swiss National Science Foundation voor Grant No. 31003A-132358/1, 31003A_152972 en nr 151.948 en Fundation Pierre Mercier pour la Science.
Whatman nitrocellulose membrane filters, 0,2 um pore size, 47 mm diameter | Sigma-Aldrich | WHA7182004 Aldrich | |
Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Aldrich | 252859 Sigma-Aldrich | CAS 77-86-1 |
EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 Sigma-Aldrich | CAS 60-00-4 |
Lysozyme from chicken egg white | Sigma-Aldrich | 62971 Fluka | powder, CAS 12650-88-3 |
Ultra-Turrax homogenizer T18 basic | IKA | 3720000 | |
Glass filter holders for 47 mm membranes, pyrex glass | EMD Millipore | XX10 047 00 | |
Chemical duty vacuum pump | Millipore | WP6122050 | 220 V/50 Hz |
Manifold sampling filtration for 25 mm membranes | Millipore | 1225 Sampling Manifold | polypropylene |
Dnase | New England Biolabs | M0303S | Rnase free |
NaOH | Sigma-Aldrich | S5881 Sigma-Aldrich | CAS 1310-73-2 |
Sodium dodecyl sulfphate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 Sigma | |
Whatman nitrocellulose membrane filters, 0,2 um pore size, 25 mm diameter | Sigma-Aldrich | WHA7182002 Aldrich |