A method to single out bacterial endospores from complex microbial communities was developed to perform tailored culture or molecular studies of this group of bacteria.
Endospore formation is a survival strategy found among some bacteria from the phylum Firmicutes. During endospore formation, these bacteria enter a morpho-physiological resting state that enhances survival under adverse environmental conditions. Even though endospore-forming Firmicutes are one of the most frequently enriched and isolated bacterial groups in culturing studies, they are often absent from diversity studies based on molecular methods. The resistance of the spore core is considered one of the factors limiting the recovery of DNA from endospores. We developed a method that takes advantage of the higher resistance of endospores to separate them from other cells in a complex microbial community using physical, enzymatic and chemical lysis methods. The endospore-only preparation thus obtained can be used for re-culturing or to perform downstream analysis such as tailored DNA extraction optimized for endospores and subsequent DNA sequencing. This method, applied to sediment samples, has allowed the enrichment of endospores and after sequencing, has revealed a large diversity of endospore-formers in freshwater lake sediments. We expect that the application of this method to other samples will yield a similar outcome.
Цель этой работы заключается в обеспечении протокол для разделения бактериальных эндоспор из растительных бактериальных клеток в пробах окружающей среды. Формирование бактериальных эндоспор является стратегией выживания, как правило, вызваны голода, обнаружили в ряде бактериальных групп, принадлежащих к типу Firmicutes 1. Эндоспоровой формирования бактерии хорошо изучены, в основном, потому, что ряд штаммов патогенных микроорганизмов и являются, следовательно, медицинское значение (например, Bacillus сибирской язвы или Clostridium несговорчивый). Экологические штаммы эндоспоровой формирования бактерий были выделены из практически каждый окружающей среды (почвы, воды, донных отложений, воздуха, льда, человек кишки, животные кишки, и более) 1-3. Таким образом, Firmicutes являются вторым наиболее распространенным типа в коллекции культур 4.
Из-за их внешний выносливых коры и защитные основных белков, эндоспоры может выжить в экстремальных условиях окружающей среды, начиная FRом высыхание высокой радиации, экстремальных температур и вредных химических веществ 5. Этот замечательный сопротивление делает его задача, чтобы извлечь ДНК из эндоспор 6-8. Это, вероятно, объясняет, почему они были упущены в окружающей секвенирования исследований 9,10. Другие методы, такие как нацеливание эндоспор в пробах окружающей среды с флуоресцентными антителами 11, количественное определение дипиколиновая кислоты (DPA) в почве 12 и 13 осадка, проточной цитометрии 14 или пастеризации и последующего культивирования 15,16 были использованы для получения или количественного эндоспоры в пробы окружающей среды. В последние годы методы экстракции ДНК оптимизирована, а также конкретные молекулярные праймеров для гена-мишени последовательности эндоспоровой конкретных были разработаны 10,17-20. Это помогло выявить более биоразнообразия среди этой группы бактерий 21 и также привело к приложениям в промышленности и медицине для обнаружения эндоспор, Например, в сухое молоко 19.
Протокол, представленные здесь, основаны на разнице в устойчивость к вредным физико-химических условий (например, температуры и моющих средств) бактериальных эндоспор относительно вегетативных клеток. Чтобы разрушить вегетативные клетки в образце, мы последовательно применяются тепла, лизоцим и низкие концентрации детергентов. Время и сила этих процедур были оптимизированы таким образом, чтобы не разрушить споры, но лизировать все вегетативные клетки. Некоторые клетки в пуле окружающей клеток более устойчивы, чем другие, так что для того, чтобы повысить вероятность разрушения всех вегетативных клеток, мы используем три различных видов лечения. Преимущество и новизна данного способа является то, что эндоспоры после обработки остаются нетронутыми и могут быть использованы для последующих анализов дальнейших. Они включают в себя добычу ДНК, количественное ПЦР (КПЦР) и ампликон или метагеномных последовательности (таргетинг специально группу эндоспор и таким образом уменьшая Diversity, в то время как увеличение охвата). Эндоспоры также могут быть использованы для последующего культивирования или количественного помощью флуоресцентной микроскопии, проточной цитометрии или обнаружение DPA. Важной особенностью данного метода является то, что при сравнении необработанного образца с обработанной пробы, можно сделать вывод, количество и разнообразие эндоспор в окружающей образца в дополнение к компоненту, соответствующую вегетативных клеток.
Сопротивление эндоспор до внешних агрессивных факторов (физико-химических, например, температуры или моющие средства) был использован для разработки метода для разделения бактериальных эндоспоры из растительных клеток в пробах окружающей среды. Это первый комплексный метод, чт?…
The authors have nothing to disclose.
Авторы признают, Швейцарский национальный научный фонд для грант № 31003A-132358/1, 31003A_152972 и № 151948, и Fundation Пьер Мерсье залить ла науки.
Whatman nitrocellulose membrane filters, 0,2 um pore size, 47 mm diameter | Sigma-Aldrich | WHA7182004 Aldrich | |
Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Aldrich | 252859 Sigma-Aldrich | CAS 77-86-1 |
EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 Sigma-Aldrich | CAS 60-00-4 |
Lysozyme from chicken egg white | Sigma-Aldrich | 62971 Fluka | powder, CAS 12650-88-3 |
Ultra-Turrax homogenizer T18 basic | IKA | 3720000 | |
Glass filter holders for 47 mm membranes, pyrex glass | EMD Millipore | XX10 047 00 | |
Chemical duty vacuum pump | Millipore | WP6122050 | 220 V/50 Hz |
Manifold sampling filtration for 25 mm membranes | Millipore | 1225 Sampling Manifold | polypropylene |
Dnase | New England Biolabs | M0303S | Rnase free |
NaOH | Sigma-Aldrich | S5881 Sigma-Aldrich | CAS 1310-73-2 |
Sodium dodecyl sulfphate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 Sigma | |
Whatman nitrocellulose membrane filters, 0,2 um pore size, 25 mm diameter | Sigma-Aldrich | WHA7182002 Aldrich |