Un Aquatic Microbial metaproteomics Flujo de trabajo: a partir de células a tríptico péptidos adecuados para el análisis basado en la espectrometría de masas en tándem

Summary

This protocol is for the extraction and concentration of protein and DNA from microbial biomass collected from seawater, followed by the generation of tryptic peptides suitable for tandem mass spectrometry-based proteomic analysis.

Abstract

Meta-omic technologies such as metagenomics, metatranscriptomics and metaproteomics can aid in the understanding of microbial community structure and metabolism. Although powerful, metagenomics alone can only elucidate functional potential. On the other hand, metaproteomics enables the description of the expressed in situ metabolism and function of a community. Here we describe a protocol for cell lysis, protein and DNA isolation, as well as peptide digestion and extraction from marine microbial cells collected on a cartridge filter unit (such as the Sterivex filter unit) and preserved in an RNA stabilization solution (like RNAlater). In mass spectrometry-based proteomics studies, the identification of peptides and proteins is performed by comparing peptide tandem mass spectra to a database of translated nucleotide sequences. Including the metagenome of a sample in the search database increases the number of peptides and proteins that can be identified from the mass spectra. Hence, in this protocol DNA is isolated from the same filter, which can be used subsequently for metagenomic analysis.

Introduction

Los microorganismos son ubicuos y juegan un papel esencial en los ciclos biogeoquímicos de la Tierra ^1. Actualmente, existen numerosos enfoques moleculares disponibles para la caracterización de estructura de la comunidad microbiana y función. El más común es el análisis de secuencias de genes de ARNr 16S amplificó por PCR a partir de ADN ambiental ^{2 – 4 de.} Una desventaja de análisis de genes 16S rRNA es que sólo proporciona información sobre la identidad filogenética y estructura de la comunidad, con poca información sobre la función metabólica. En contraste, los enfoques tales como la metagenómica, metatranscriptomics y metaproteomics proporcionan información sobre la estructura de la comunidad y el metabolismo. La metagenómica, o el análisis del contenido de genes de un conjunto de organismos, incluye información sobre la estructura y el potencial funcional de la comunidad ^5-8. Aunque potente, este potencial funcional no puede corresponder a la metabólicalas actividades de los organismos. El genotipo de un organismo está representada por sus genes, cada uno de los cuales puede ser transcrito a ARN y traducido además a la proteína, dando como resultado un fenotipo. Por lo tanto, para ayudar en la comprensión de la actividad funcional microbiana en un ambiente, el análisis post-genómica se debe realizar ^9. Metatranscriptomics, o el análisis de las transcripciones de ARN es útil porque revela que los genes se transcriben en cualquier ambiente dado. Sin embargo, los niveles de mRNA no siempre coinciden con sus correspondientes niveles de proteína debido a la regulación de la traducción, la vida media del ARN, y el hecho de que varias copias de la proteína se pueden generar para cada mRNA ^10.

Por estas razones metaproteomics ahora se reconoce como una herramienta importante para la microbiología ambiental. Metaproteomic Común analiza utilizar un enfoque proteómico escopeta donde el complemento completo cerca de las proteínas en una muestra compleja se purifican y analizan simultáneamente, por lo general a través de endigestión zymatic en péptidos y análisis sobre un espectrómetro de masas. Con posterioridad espectrometría de masas en tándem (MS / MS) "huellas dactilares péptido" se utiliza para determinar la secuencia del péptido y el potencial de proteínas de origen por la búsqueda de datos de proteínas (para una revisión ver ^11). Trabajo proteómico ha recorrido un largo camino en los últimos 25 años gracias al aumento de la disponibilidad de datos genómica y el aumento de la sensibilidad y la precisión de los espectrómetros de masas que permitan la identificación de proteínas de alto rendimiento y cuantificación ^11,12. Dado que las proteínas son el producto final de la expresión génica, los datos metaproteomic pueden ayudar a determinar qué organismos están activos en un entorno determinado y qué proteínas están expresando. Esto es una ventaja cuando se trata de determinar cómo un conjunto particular de variables ambientales afectará el fenotipo de un organismo o comunidad. Desde el principio, se utilizaron estudios metaproteomic basados ​​en MS MS / en el océano para identificar proteínas específicas dirigidaslinajes microbianos, con el primer estudio se centra en la luz impulsado protones bomba proteorhodopsin en bacterias marinas SAR11 ^13. Más recientemente, los análisis comparativos metaproteomic han dilucidado los patrones de expresión de proteínas diferenciales entre comunidades complejas. Los ejemplos incluyen la identificación de los cambios temporales en el metabolismo de la costa noroeste del Océano Atlántico ^{14 o} la Península Antártica ^5. Otros estudios han descrito variaciones en los patrones de expresión de proteínas a través de escalas espaciales, por ejemplo, a lo largo de un transecto geográfico de un giro oceánico bajo de nutrientes a un sistema de surgencia costera altamente productiva ^15. Para más críticas del metaproteomics recomendamos Schneider et al. (2010) ⁹ y Williams et al. (2014) ^16. Proteómica dirigidos también se ha empleado en los últimos años para cuantificar la expresión de las vías metabólicas específicas en el entorno ^17,18.

El Re son tres fases principales en el análisis metaproteomic. La primera fase es la preparación de muestras, que incluye la recogida de muestras, la lisis celular y la concentración de proteína. La recogida de muestras en microbiología marina a menudo implica la filtración de agua de mar a través de un pre-filtro para eliminar las células más grandes eucariotas, partículas y bacterias de partículas asociadas, seguido de filtración para la captura de células microbianas de estar libres, comúnmente con el uso de un cartucho de 0,22 micras unidad de filtro de ^19,20. Estos filtros son incased en un cilindro de plástico y una lisis celular y el protocolo de extracción de proteínas que se pueden realizar dentro de la unidad de filtro sería una herramienta valiosa. Una vez que se obtiene la biomasa, las células deben ser lisadas para permitir la extracción de proteínas. Varios métodos pueden ser empleados, incluyendo guanidina-HCl sulfato de lisis ²¹ y sodio dodecil (SDS) basados ​​en métodos de lisis. Aunque los detergentes como SDS son muy eficientes en la interrupción de las membranas y solubilizar muchos tipos de proteínas, concentrations precio tan bajo como 0.1% puede interferir con la digestión de proteínas aguas abajo y el análisis MS ^22. De mayor preocupación es los efectos negativos de la SDS en la eficiencia digestión con tripsina, poder de resolución de la cromatografía líquida en fase inversa y la supresión de iones o la acumulación dentro de la fuente de iones ^23.

La segunda fase es de fraccionamiento y análisis, donde las proteínas son sometidas a digestión enzimática seguida por análisis LC MS / MS, dando como resultado patrón de fragmentación am / z que se puede utilizar para determinar la secuencia primaria de aminoácidos del péptido tríptico inicial. Varios métodos de digestión se pueden realizar dependiendo de los tipos de detergentes utilizados, así como el flujo de trabajo aguas abajo espectrometría de masas. En nuestro protocolo, electroforesis PAGE 1-D seguido de la eliminación de SDS a partir del gel se utiliza con el fin de eliminar cualquier contaminación de detergente. El análisis de las proteínas que son difíciles de solubilizar, tales como proteínas de la membrana, requiere el uso de alta concentraciones de SDS u otros detergentes. Esto conduce a problemas de compatibilidad con electroforesis en SDS-gel. Si el objetivo de un estudio requiere la solubilización de estos duros para solubilizar las proteínas, el sistema de tubo de gel se puede utilizar ^22,24. El método del tubo-gel incorpora proteínas dentro de la matriz de gel sin el uso de electroforesis. Posteriormente los detergentes utilizados para la solubilización se retiran antes de la digestión de proteínas.

La tercera fase es la análisis bioinformático. En esta fase los datos de péptidos MS / MS se busca en una base de datos de secuencias de nucleótidos traducidas para determinar que están presentes en la muestra de péptidos y proteínas. La identificación de péptidos depende de la base de datos es buscado en contra. Datos metaproteomic Marinos son comúnmente búsquedas en contra de las bases de datos compuestas de genomas de referencia, datos de metagenómica como el conjunto de datos Global Océano Muestreo ^25, así como los genomas celulares amplificadas individuales de li sin cultivarneages ^26,27. Identificación de proteínas también se puede aumentar mediante la inclusión de secuencias metagenomic de la misma muestra como los datos metaproteomic se derivó ^5.

Aquí nos proporcionan un protocolo para la generación de péptidos adecuados para el análisis basado en MS MS / a partir de biomasa microbiana recogió por filtración y almacenados en una solución de estabilización de ARN. El protocolo descrito aquí permite ADN y proteínas para aislar a partir de la misma muestra para que todos los pasos que conducen a la proteína y las precipitaciones de ADN son idénticos. Desde una perspectiva práctica, se requiere menos de filtración ya que sólo se requiere un filtro para proteínas y extracción de ADN. También nos gustaría reconocer que este protocolo fue creado a través de la combinación, la adaptación y modificación de los dos protocolos previamente publicados. Los pasos de lisis celular son una adaptación de Saito et al. (2011) ^{28 y la} tripsina en gel digerir componente se adapta de ShevcheNKO et al. (2007) ^29.

Protocol

1. Prepare Reactivos Preparar la solución de SDS-extracción: M Tris-HCl pH 0,1 7,5, 5% de glicerol, EDTA 10 mM y 1% de SDS. Filtro-esterilizar utilizando un filtro y tienda de 0,22 micras a 4 ° C. Preparar reactivos de valores necesarios para el gel de poliacrilamida. Preparar 1,5 M Tris-HCl pH 8,8. Filter-esterilizar utilizando un filtro de 0,22 micras y almacenar a temperatura ambiente. 0,5 M Tris-HCl pH 6,8. Filter-esterilizar utilizando un filtro de 0,22 micras y almacenar …

Representative Results

Como demostración, se realizó el protocolo en dos muestras de agua de mar recogidas de la superficie y el máximo de clorofila del océano costero en el norte de Canadá. Mientras que en el mar, 6-7 de L de agua de mar se pasó a través de un GF / D prefiltro 3 micras, a continuación, se recogieron las células microbianas en una unidad de filtro de cartucho de 0,22 micras siguiendo el protocolo de Walsh et al. 20. Las células se almacenan inmediatamente en una solución de estabilización de AR…

Discussion

La preservación de la muestra es clave para estudios metaproteomic y el trabajo previo demostró que una solución de estabilización de ARN es un tampón de almacenamiento útil para almacenar las células antes de la extracción de proteínas ^28. Idealmente, las muestras se conservan in situ para negar los cambios en la expresión de la proteína durante la manipulación ^33,34. De hecho, in situ se han desarrollado tecnologías de muestreo y fijación, que permiten la colecció…

Materials

Sterivex -GP 0.22 μm filter unit	Millipore	SVGP01050	Sampling
RNAlater Stabilization Solution	Ambion	AM7021	Sampling
Tris	Bio Basic	77-86-1 or TB0196-500G	Protein Extraction/ SDS PAGE gel
DTT	Sigma-Aldrich	D0632-1G	Protein Extraction
SDS	Bio Basic	15-21-3	Protein Extraction/ SDS PAGE gel
EDTA	Bio Basic	6381-92-6	Protein Extraction
Glycerol	Fisher Scientific	56-81-5	Protein Extraction
10K Amicon Filter	Millipore	UFC801024	Protein Extraction
Methanol	Sigma-Aldrich	179337-4L	Protein Precipitation
Acetone	Fisher Scientific	67-64-1	Protein Precipitation
MPC Protein Precipitation reagent	Epicenter	mmP03750	DNA Precipitation
2-Propanol	Fisher Scientific	67-63-0	DNA Precipitation
Qubit dsDNA BR Assay kit	Life Technologies	Q32850	DNA Quantification
Qubit Protein Assay kit	Life Technologies	Q33211	Protein Quantification
Sucrose	Bio Basic	57-50-1	SDS PAGE gel
TEMED	Bio Rad	161-0800	SDS PAGE gel
APS	Bio Rad	161-0700	SDS PAGE gel
30% Acrylamide	Bio Rad	161-0158	SDS PAGE gel
SimplyBlue SafeStain	Invitrogen	LC6060	SDS PAGE gel
Glycine	Bio Rad	161-0718	SDS PAGE gel
B-mercaptoethanol	Bio Basic	60-24-2	SDS PAGE gel
Laemmli Sample Buffer	Bio Rad	161-0737	SDS PAGE gel
Precision Plus Protein Kaleidoscope Ladder	Bio Rad	161-0375EDU	SDS PAGE gel
Acetonitrile	VWR	CABDH6044-4	In-gel Trypsin digest
NH4HCO3	Bio Basic	1066-33-7	In-gel Trypsin digest
DTT	Sigma-Aldrich	D0632-1G	In-gel Trypsin digest
Formic Acid	Sigma-Aldrich	F0507-500ML	In-gel Trypsin digest
HPLC grade H2O	Sigma-Aldrich	270733-4L	In-gel Trypsin digest
Iodoacetamide	Bio Basic	144-48-9	In-gel Trypsin digest
Trypsin	Promega	V5111	In-gel Trypsin digest
Protein LoBind Tube 1.5ml	Eppendorf	22431081	In-gel Trypsin digest
2mL ROBO vial 9mm	Candian Life Science	VT009/C395SB	In-gel Trypsin digest
PP BM insert, No spring	Candian Life Science	4025P-631	In-gel Trypsin digest