Metaproteomics זרימת עבודה Aquatic מיקרוביאלית: מתאים לtryptic פפטידים מתאימים לניתוח מבוסס ספקטרומטריית מסת טנדם

Summary

This protocol is for the extraction and concentration of protein and DNA from microbial biomass collected from seawater, followed by the generation of tryptic peptides suitable for tandem mass spectrometry-based proteomic analysis.

Abstract

Meta-omic technologies such as metagenomics, metatranscriptomics and metaproteomics can aid in the understanding of microbial community structure and metabolism. Although powerful, metagenomics alone can only elucidate functional potential. On the other hand, metaproteomics enables the description of the expressed in situ metabolism and function of a community. Here we describe a protocol for cell lysis, protein and DNA isolation, as well as peptide digestion and extraction from marine microbial cells collected on a cartridge filter unit (such as the Sterivex filter unit) and preserved in an RNA stabilization solution (like RNAlater). In mass spectrometry-based proteomics studies, the identification of peptides and proteins is performed by comparing peptide tandem mass spectra to a database of translated nucleotide sequences. Including the metagenome of a sample in the search database increases the number of peptides and proteins that can be identified from the mass spectra. Hence, in this protocol DNA is isolated from the same filter, which can be used subsequently for metagenomic analysis.

Introduction

מיקרואורגניזמים נמצאים בכל מקום ולשחק תפקידים חיוניים במחזורי biogeochemical של כדור הארץ ^1. נכון לעכשיו, יש גישות מולקולריות רבות זמינות לאפיון מבנה קהילת חיידקים ותפקוד. הנפוץ ביותר הוא הניתוח של גן 16S rRNA רצפי PCR-מוגבר מ- DNA הסביבתי ^{2 – 4.} חסרון של ניתוח גנטי 16S rRNA הוא שזה רק מספק מידע על זהות פילוגנטי ומבנה קהילה, עם מעט מידע על תפקוד מטבולים. לעומת זאת, גישות כגון metagenomics, metatranscriptomics וmetaproteomics לספק מידע על מבנה קהילה וחילוף חומרים. Metagenomics, או הניתוח של תוכן הגן של מכלול של אורגניזמים, מספק מידע על המבנה ואת הפוטנציאל התפקודי של הקהילה ^{5 – 8.} למרות עוצמה, פוטנציאל פונקציונלי זה לא מתאים מטבוליםפעילות של אורגניזמים. גנוטיפ של האורגניזם מיוצג על ידי הגנים שלו, כל אחד מהם יכול להיות עיבד ותרגמו לרנ"א לחלבון נוסף, וכתוצאה מכך פנוטיפ. לכן, כדי לסייע בהבנה של פעילות פונקציונלית של חיידקים בסביבה, ניתוח שלאחר הגנומי צריך להתבצע ^9. Metatranscriptomics, או הניתוח של תעתיקי רנ"א הוא שימושי משום שהוא חושף שגנים מתועתקים בכל סביבת נתונה. עם זאת, רמות ה- mRNA לא תמיד תואמות את רמות החלבון המתאימים בשל רגולציה translational, RNA מחצית חיים, והעובדה שעותקים חלבון מרובים יכולים להיות שנוצרו עבור כל mRNA ^10.

לmetaproteomics מסיבות אלה מוכר כיום ככלי חשוב למיקרוביולוגיה הסביבתית. הנפוץ metaproteomic מנתח להשתמש בגישת proteomic רובה שבו ההשלמה מלאה ליד של חלבונים במדגם מורכב הם מטוהרים ונותחה בו-זמנית, בדרך כלל באמצעות enעיכול zymatic לפפטידים וניתוח על ספקטרומטר מסה. ספקטרומטר מסת טנדם לאחר (MS / MS) "טביעת אצבע פפטיד" משמשת כדי לקבוע את רצף הפפטיד וחלבון פוטנציאלי ממוצא ידי מסד נתוני חלבון חיפוש (לסקירה ראה ^11). עבודת proteomic יש כברת דרך ארוכה ב -25 השנים האחרונות הודות לעלייה בזמינויות הנתונים הגנומי והעלייה ברגישות והדיוק של ספקטרומטרים המוניים המאפשרים זיהוי חלבון תפוקה גבוהה וכימות ^11,12. מאז חלבונים הם המוצר הסופי של ביטוי גנים, נתונים metaproteomic יכולים לעזור לקבוע אילו אורגניזמים פעילים בכל סביבה ומה חלבונים הם מביעים נתון. זהו יתרון כאשר מנסים לקבוע איך קבוצה מסוימת של משתנים סביבתיים תשפיע על הפנוטיפ של האורגניזם או קהילה. בשלב מוקדם, מחקרי metaproteomic מבוססי MS MS / בים היו משמשים לזיהוי חלבונים ספציפיים בממוקדשושלות חיידקים, עם המחקר הראשון מתמקד בproteorhodopsin משאבת פרוטון האור מונע בחיידקים הימיים SAR11 ^13. לאחרונה, ניתוחי metaproteomic השוואתיים שהובהרו דפוסי ביטוי חלבון ההפרש בין קהילות מורכבות. דוגמאות כוללות זיהוי של משמרות זמניות בחילוף חומרים בצפון-מערב האוקיינוס ​​האטלנטי חוף ¹⁴ או חצי האי האנטארקטי ^5. מחקרים אחרים תיארו שינויים בדפוסי ביטוי חלבון על פני קשקשים מרחבית, למשל, לרוחב, גיאוגרפי מסיבובי אוקיינוס ​​נמוך תזונתיים למערכת upwelling חוף פרודוקטיבי ^15. לביקורות נוספות של metaproteomics אנו ממליצים שניידר et al. (2010) ⁹ ווויליאמס et al. (2014) ^16. פרוטאומיקה ממוקדת גם הועסקה בשנים האחרונות לכמת ביטוי של מסלולי מטבוליים מסוימים בסביבה ^17,18.

Therדואר שלושה שלבים עיקריים בניתוח metaproteomic. השלב הראשון הוא הכנת מדגם, הכוללת איסוף דגימה, תמוגה תא וריכוז של חלבון. אוסף מדגם במיקרוביולוגיה הימית לעתים קרובות כרוך בסינון של מי ים דרך מראש מסנן כדי להסיר תאים גדולים יותר אוקריוטים, חלקיקים וחיידקים הקשורים חלקיקים, ואחרי סינון ללכידתו של תאי חיידקי חיים חופשיים, בדרך כלל עם השימוש במחסנית 0.22 מיקרומטר יחידת מסנן ^19,20. מסננים אלה עטויות כפפה בגליל פלסטיק ותמוגה תא ופרוטוקול מיצוי חלבון שניתן לבצע בתוך יחידת המסנן יהיה כלי רב ערך. ברגע שמתקבלת ביומסה, התאים חייבים להיות lysed כדי לאפשר מיצוי חלבון. יכולים להיות מועסקים במספר שיטות, כולל סולפט guanidine-HCl dodecyl תמוגה ²¹ ונתרן (SDS) שיטות תמוגה מבוססות. למרות שחומרי ניקוי כמו SDS הם מאוד יעילים בשיבוש קרומים וsolubilizing סוגים רבים חלבון, concentratiONS נמוך כמו 0.1% יכולים להפריע לעיכול חלבון במורד הזרם וניתוח MS ^22. דאגה עיקרית הוא ההשפעות השליליות של SDS על יעילות עיכול טריפסין, פתרון כוח של כרומטוגרפיה נוזלית הפוכה שלב ודיכוי יון או הצטברות בתוך יון המקור ^23.

השלב השני הוא חלוקה וניתוח, שבו חלבוני נתונים לעיכול אנזימטי ואחרי ניתוח LC MS / MS, וכתוצאה מכך דפוס פיצול בבוקר / z שניתן להשתמש בי לברר את רצף חומצות אמינו העיקרי של הפפטיד tryptic הראשוני. ניתן לבצע שיטות עיכול שונות בהתאם לסוגים של חומרי ניקוי המשמשים, כמו גם את העבודה ספקטרומטר מסה במורד הזרם. בפרוטוקול שלנו, אלקטרופורזה עמוד 1-D ואחריו ההסרה של SDS מג'ל מנוצלת כדי להסיר כל זיהום חומר ניקוי. הניתוח של חלבונים שקשה solubilize, כגון חלבוני קרום, מחייב השימוש גבוה concentrations של SDS או חומרי ניקוי אחרים. זה מוביל לבעיות תאימות עם אלקטרופורזה SDS-ג'ל. אם מטרתו של מחקר דורשת solubilization קשה אלה לsolubilize חלבונים, מערכת הצינור-ג'ל ניתן להשתמש ^22,24. שיטת הצינור-ג'ל משלבת חלבונים בתוך מטריצת ג'ל ללא השימוש באלקטרופורזה. בהמשך לכך כל חומרי ניקוי המשמש לsolubilization יוסרו לפני עיכול חלבון.

השלב השלישי הוא ניתוח bioinformatic. בשלב זה נתונים פפטיד MS / MS הם חיפשו מול מסד נתונים של רצפי נוקליאוטידים תרגמו כדי לקבוע אילו פפטידים וחלבונים נמצאים במדגם. זיהוי של פפטידים תלוי בבסיס הנתונים שהוא חיפש נגד. נתונים metaproteomic ימיים חיפשו נפוצים מול מסדי נתונים מורכבים מהגנום התייחסות, נתונים metagenomic כגון בסיס הנתונים הגלובלי אוקיינוס ​​דגימת ^25, כמו גם הגנום תא מוגבר אחד מli הבורneages ^26,27. זיהוי חלבון גם יכול להיות מוגבר על ידי ההכללה של רצפי metagenomic מאותו המדגם נתונים metaproteomic נגזר ^5.

כאן אנו מספקים פרוטוקול עבור הדור של פפטידים מתאימים לניתוח מבוסס MS MS / ביומסה חיידקים שנאספו על ידי סינון ומאוחסנים בפתרון ייצוב RNA. הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר לדנ"א וחלבון להיות מבודדים מאותו המדגם, כך שכל הצעדים שהובילו לחלבון ומשקעי DNA זהים. מנקודת מבט מעשית, נדרש פחות סינון שכן רק אחד מסנן נדרש לחלבון וגם מיצוי DNA. אנחנו רוצים גם להודות שפרוטוקול זה נוצר באמצעות שילוב, עיבוד והשינוי של שני פרוטוקולים שפורסמו בעבר. צעדי תמוגה התא מותאמים מאל סאיטו et. (2011) ²⁸ וטריפסין ב- ג'ל לעכל רכיב מותאם ShevcheNKO et al. (2007) ^29.

Protocol

1. הכן ריאגנטים הכן פתרון SDS-חילוץ: 0.1 M טריס- HCl pH 7.5, גליצרול 5%, 10 mM EDTA ו -1% SDS. מסנן לעקר באמצעות מסנן וחנות 0.22 מיקרומטר על 4 מעלות צלזיוס. הכן ריאגנטים מניות דרושים לג'ל polyacrylamide. <ol style=";text-align:right;d…

Representative Results

כהפגנה, שבצענו את הפרוטוקול בשתי דגימות מי ים שנאספו מפני השטח ומקסימום כלורופיל של אוקיינוס ​​החוף בצפון קנדה. בעוד בים, 6-7 ליטר של מי ים עבר דרך prefilter / GF D 3 מיקרומטר, אז תאי חיידקים נאספו על יחידת מסנן מחסנית 0.22 מיקרומטר הבא הפרוטוקול של et al וולש. 20. תאים או?…

Discussion

שימור דגימה הוא מפתח ללימודי metaproteomic והעבודה קודמת הוכיחה כי פתרון ייצוב RNA הוא חיץ אחסון שימושי לאחסון תאים לפני מיצוי חלבון ^28. באופן אידיאלי, דגימות תישמרנה באתר לשלול משמרות בביטוי חלבון במהלך טיפול ^33,34. למעשה, באתר טכנולוגיות דגימה וקיבעון פו…

Materials

Sterivex -GP 0.22 μm filter unit	Millipore	SVGP01050	Sampling
RNAlater Stabilization Solution	Ambion	AM7021	Sampling
Tris	Bio Basic	77-86-1 or TB0196-500G	Protein Extraction/ SDS PAGE gel
DTT	Sigma-Aldrich	D0632-1G	Protein Extraction
SDS	Bio Basic	15-21-3	Protein Extraction/ SDS PAGE gel
EDTA	Bio Basic	6381-92-6	Protein Extraction
Glycerol	Fisher Scientific	56-81-5	Protein Extraction
10K Amicon Filter	Millipore	UFC801024	Protein Extraction
Methanol	Sigma-Aldrich	179337-4L	Protein Precipitation
Acetone	Fisher Scientific	67-64-1	Protein Precipitation
MPC Protein Precipitation reagent	Epicenter	mmP03750	DNA Precipitation
2-Propanol	Fisher Scientific	67-63-0	DNA Precipitation
Qubit dsDNA BR Assay kit	Life Technologies	Q32850	DNA Quantification
Qubit Protein Assay kit	Life Technologies	Q33211	Protein Quantification
Sucrose	Bio Basic	57-50-1	SDS PAGE gel
TEMED	Bio Rad	161-0800	SDS PAGE gel
APS	Bio Rad	161-0700	SDS PAGE gel
30% Acrylamide	Bio Rad	161-0158	SDS PAGE gel
SimplyBlue SafeStain	Invitrogen	LC6060	SDS PAGE gel
Glycine	Bio Rad	161-0718	SDS PAGE gel
B-mercaptoethanol	Bio Basic	60-24-2	SDS PAGE gel
Laemmli Sample Buffer	Bio Rad	161-0737	SDS PAGE gel
Precision Plus Protein Kaleidoscope Ladder	Bio Rad	161-0375EDU	SDS PAGE gel
Acetonitrile	VWR	CABDH6044-4	In-gel Trypsin digest
NH4HCO3	Bio Basic	1066-33-7	In-gel Trypsin digest
DTT	Sigma-Aldrich	D0632-1G	In-gel Trypsin digest
Formic Acid	Sigma-Aldrich	F0507-500ML	In-gel Trypsin digest
HPLC grade H2O	Sigma-Aldrich	270733-4L	In-gel Trypsin digest
Iodoacetamide	Bio Basic	144-48-9	In-gel Trypsin digest
Trypsin	Promega	V5111	In-gel Trypsin digest
Protein LoBind Tube 1.5ml	Eppendorf	22431081	In-gel Trypsin digest
2mL ROBO vial 9mm	Candian Life Science	VT009/C395SB	In-gel Trypsin digest
PP BM insert, No spring	Candian Life Science	4025P-631	In-gel Trypsin digest