水生微生物Metaproteomicsワークフロー：細胞からのトリプシンペプチドのタンデム質量分析ベースの分析に適し

Summary

This protocol is for the extraction and concentration of protein and DNA from microbial biomass collected from seawater, followed by the generation of tryptic peptides suitable for tandem mass spectrometry-based proteomic analysis.

Abstract

Meta-omic technologies such as metagenomics, metatranscriptomics and metaproteomics can aid in the understanding of microbial community structure and metabolism. Although powerful, metagenomics alone can only elucidate functional potential. On the other hand, metaproteomics enables the description of the expressed in situ metabolism and function of a community. Here we describe a protocol for cell lysis, protein and DNA isolation, as well as peptide digestion and extraction from marine microbial cells collected on a cartridge filter unit (such as the Sterivex filter unit) and preserved in an RNA stabilization solution (like RNAlater). In mass spectrometry-based proteomics studies, the identification of peptides and proteins is performed by comparing peptide tandem mass spectra to a database of translated nucleotide sequences. Including the metagenome of a sample in the search database increases the number of peptides and proteins that can be identified from the mass spectra. Hence, in this protocol DNA is isolated from the same filter, which can be used subsequently for metagenomic analysis.

Introduction

微生物は、ユビキタスであり、地球の物質循環¹に重要な役割を果たしています。現在、微生物群集の構造と機能を特徴づけるために利用可能な多数の分子アプローチがあります。 ^{4 –}最も一般的な16S rRNA遺伝子配列の分析は、環境DNA ²からPCR増幅されます。 16S rRNA遺伝子解析の欠点は、それが唯一の代謝機能にはほとんどの情報を、系統発生的アイデンティティと社会構造についての情報を提供することです。これとは対照的に、このようなメタゲノミクス、metatranscriptomicsとmetaproteomicsとしてのアプローチは、コミュニティの構造と代謝に​​関する情報を提供しています。 ^{8 –}メタゲノミクス、または生物の集合体の遺伝子含有量の分析は、社会⁵の構造と機能の可能性についての情報を提供します。強力なものの、この機能の可能性は、代謝に対応しない場合があります生物の活動。生物の遺伝子型は、RNAに転写し、さらに表現型をもたらす、タンパク質に翻訳することができるそれらの各々は、その遺伝子によって表されます。従って、環境中の微生物の機能的活性の理解を助けるために、ポストゲノム解析は^、9実行されるべきです。それは任意の環境で転写される遺伝子を明らかにするためMetatranscriptomics、またはRNA転写物の分析に便利です。しかし、mRNAのレベルは、常に翻訳調節、RNAの半減期、および複数のタンパク質コピーは、すべてのmRNAの¹⁰のために生成することができるという事実に起因し、それらの対応するタンパク質のレベルと一致しません。

これらの理由のmetaproteomicsのために今の環境微生物学のための重要なツールとして認識されています。共通metaproteomicは、複雑なサンプル中のタンパク質のほぼ完全な補完は、通常エンを通して、精製し、同時に分析されているショットガンプロテオミクスのアプローチを使用して分析します質量分析計のペプチドおよび分析にzymatic消化。続くタンデム質量分析（MS / MS）「ペプチドフィンガープリント」は、タンパク質データベース検索によって、ペプチド配列および起源の可能性タンパク質（概説については^{11を参照）を}決定するために使用されます。プロテオミクスの研究は、過去25年間で、ゲノムデータの可用性の増加や高スループットのタンパク質の同定および定量^11,12を可能にする質量分析計の感度および精度の向上のおかげで長い道のりを歩んできました。タンパク質は、遺伝子発現の最終産物であるので、metaproteomicデータは、任意の与えられた環境で活性である生物、それらが発現しているものタンパク質を判断するのに役立ちます。環境変数の特定のセットは、生物やコミュニティの表現型にどのように影響するかを決定しようとする場合に有利です。初期の段階では、海でのMS / MSベースmetaproteomic研究が対象となるの特定のタンパク質を同定するために使用されましたSAR11の海洋細菌¹³の光駆動プロトンポンプテオに焦点を当てた最初の研究で、微生物系統、。より最近では、比較metaproteomic分析が複雑な地域社会との差タンパク質発現パターンを解明しました。例としては、沿岸北西部大西洋¹⁴または南極半島⁵における代謝の時間的シフトの識別が含まれます。他の研究では、生産性の高い沿岸湧昇^システム 15に低栄養環流から地理的トランセクトに沿って、例えば、空間スケールを越えタンパク質発現パターンの変化を説明しています。 metaproteomicsのさらなるレビューのために我々はシュナイダーら ^{（2010）9、}ウィリアムズら （2014年^）16をお勧めします。標的プロテオミクスはまた、環境^17,18における特定の代謝経路の発現を定量するために近年使用されています。

THEReはmetaproteomic分析には、主な3つの相です。第一段階は、試料収集、細胞溶解及びタンパク質の濃度を含むサンプル調製です。海洋微生物のサンプルの収集は、多くの場合、一般に、0.22μmのカートリッジを使用して、自由生活微生物細胞の捕捉のためにろ過し、より大きな真核生物細胞、粒子と粒子に関連する細菌を除去するためにプレフィルターを通して海水の濾過を伴いますフィルタユニット^19,20。これらのフィルタは、プラスチックシリンダーでincasedされ、フィルタユニット内で実行することができる細胞溶解及びタンパク質抽出プロトコルは、貴重なツールであろう。バイオマスが得られると、細胞は、タンパク質抽出を可能にするために溶解されなければなりません。いくつかの方法は、溶解法をベースグアニジン-HCl溶解²¹とドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を含む、使用することができます。 SDSのような界面活性剤は、膜を破壊し、多くのタンパク質の種類を可溶化でconcentrati非常に効率的であるが、下流タンパク質消化及びMS分析²²に干渉することが0.1％と低く、ONS。主要な関心事のイオン源^23内の逆相液体クロマトグラフィーとイオン抑制または蓄積の解像力、トリプシン消化効率にSDSの悪影響です。

第二段階は、タンパク質が、最初のトリプシンペプチドの一次アミノ酸配列を確認するために使用することができるAM / zの断片化パターンをもたらす、LC MS / MS分析に続いて酵素消化に供される分画及び分析です。さまざまな消化方法が使用される界面活性剤の種類、ならびに下流の質量分析ワークフローに応じて行うことができます。我々のプロトコルでは、ゲルのSDSを除去した1次元PAGE電気泳動は、任意の洗剤汚染を除去するために利用されています。このような膜タンパク質として、可溶化することが困難であるタンパク質の分析は、高いconcenの使用を必要としますSDSまたは他の界面活性剤のtrations。これは、SDSゲル電気泳動との互換性の問題につながります。研究の目的は、タンパク質を可溶化するために、これらの硬質の可溶化を必要とする場合、チューブゲルシステムは^、22,24を使用することができます。チューブゲル法、電気泳動を使用することなく、ゲルマトリックス内のタンパク質を組み込みます。続いて可溶化するために使用される任意の界面活性剤は、タンパク質消化の前に削除されます。

第三段階は、バイオインフォマティクス解析です。この段階でMS / MSペプチドデータは、サンプル中に存在するペプチドおよびタンパク質を決定するために翻訳されたヌクレオチド配列データベースに対して検索されます。ペプチドの同定は、それがに対して検索されているデータベースに依存しています。マリンmetaproteomicデータは、一般的に参照ゲノムから成るデータベースに対して検索され、そのようなグローバル・オーシャン・サンプリングデータセット^25、ならびに単一セルとメタゲノムのデータが未培養のLiからゲノムを増幅します^26,27 neages。タンパク質同定はまたmetaproteomicデータ^は 5導出されたのと同じ試料からメタゲノム配列を含めることによって増加させることができます。

ここでは、微生物バイオマスからのMS / MSに基づく分析を濾過により回収し、RNA安定化溶液中で保存するのに適したペプチドを生成するためのプロトコルを提供します。 DNAとタンパク質は、同じ試料から単離するためのタンパク質およびDNAの沈殿に至るまでのすべてのステップが同じになるように、ここで説明されたプロトコルができます。唯一のフィルタは、タンパク質およびDNA抽出の両方のために必要とされるので、実用上の観点から、より少ない濾過が必要とされます。また、このプロトコルは2以前に公開されたプロトコルの組み合わせ、適応及び改変によって作成されたことを感謝したいです。細胞溶解工程は、斎藤ら^{。（2011）28、}コンポーネントがShevcheから適応されるダイジェストゲル内トリプシンから適応されていますNKOら。 （2007年^）29。

Protocol

1.試薬を準備 0.1 MのTris-HCl pH7.5で、5％グリセロール、10mMのEDTA及び1％SDS：SDS抽出溶液を調製します。 4℃で0.22μmフィルターとストアを使用してフィルター滅菌します。 ポリアクリルアミドゲルに必要な株式試薬を準備します。 1.5 Mトリス塩酸pHが8.8を準備します。室温で0.22μmフィルターとストアを使用してフィルター滅菌します。 0.5 Mトリス塩酸pHは6.8。室温で0….

Representative Results

デモンストレーションとして、我々は、二つの表面から採取した海水サンプルとカナダ北部の沿岸海洋のクロロフィル最大でプロトコルを行いました。海で、海水の6-7 Lが3μmのGF / Dをプレフィルターに通したが、その後、微生物細胞は、ウォルシュら 20のプロトコルに従って、0.22μmのカートリッジフィルターユニットに収集しました。細胞はすぐにさらに処理されるまでRNA安?…

Discussion

サンプル保存はmetaproteomic研究の鍵であると前作は、RNA安定化溶液は、前タンパク質抽出²⁸に細胞を収納するのに便利記憶バッファであることを実証しました。理想的には、サンプルは^33,34を取り扱い中のタンパク質発現の変化を打ち消すために、その場で保持されることになります。実際には、 その場でサンプリングし、固定技術が船配備楽器による自律的な収…

Materials

Sterivex -GP 0.22 μm filter unit	Millipore	SVGP01050	Sampling
RNAlater Stabilization Solution	Ambion	AM7021	Sampling
Tris	Bio Basic	77-86-1 or TB0196-500G	Protein Extraction/ SDS PAGE gel
DTT	Sigma-Aldrich	D0632-1G	Protein Extraction
SDS	Bio Basic	15-21-3	Protein Extraction/ SDS PAGE gel
EDTA	Bio Basic	6381-92-6	Protein Extraction
Glycerol	Fisher Scientific	56-81-5	Protein Extraction
10K Amicon Filter	Millipore	UFC801024	Protein Extraction
Methanol	Sigma-Aldrich	179337-4L	Protein Precipitation
Acetone	Fisher Scientific	67-64-1	Protein Precipitation
MPC Protein Precipitation reagent	Epicenter	mmP03750	DNA Precipitation
2-Propanol	Fisher Scientific	67-63-0	DNA Precipitation
Qubit dsDNA BR Assay kit	Life Technologies	Q32850	DNA Quantification
Qubit Protein Assay kit	Life Technologies	Q33211	Protein Quantification
Sucrose	Bio Basic	57-50-1	SDS PAGE gel
TEMED	Bio Rad	161-0800	SDS PAGE gel
APS	Bio Rad	161-0700	SDS PAGE gel
30% Acrylamide	Bio Rad	161-0158	SDS PAGE gel
SimplyBlue SafeStain	Invitrogen	LC6060	SDS PAGE gel
Glycine	Bio Rad	161-0718	SDS PAGE gel
B-mercaptoethanol	Bio Basic	60-24-2	SDS PAGE gel
Laemmli Sample Buffer	Bio Rad	161-0737	SDS PAGE gel
Precision Plus Protein Kaleidoscope Ladder	Bio Rad	161-0375EDU	SDS PAGE gel
Acetonitrile	VWR	CABDH6044-4	In-gel Trypsin digest
NH4HCO3	Bio Basic	1066-33-7	In-gel Trypsin digest
DTT	Sigma-Aldrich	D0632-1G	In-gel Trypsin digest
Formic Acid	Sigma-Aldrich	F0507-500ML	In-gel Trypsin digest
HPLC grade H2O	Sigma-Aldrich	270733-4L	In-gel Trypsin digest
Iodoacetamide	Bio Basic	144-48-9	In-gel Trypsin digest
Trypsin	Promega	V5111	In-gel Trypsin digest
Protein LoBind Tube 1.5ml	Eppendorf	22431081	In-gel Trypsin digest
2mL ROBO vial 9mm	Candian Life Science	VT009/C395SB	In-gel Trypsin digest
PP BM insert, No spring	Candian Life Science	4025P-631	In-gel Trypsin digest