A continuación, presentamos un protocolo para generar un adenovirus divalente tipo 5 (Ad5) vectores de prueba de principio Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-Su 6 mediante la utilización de la estrategia de antígeno de la cápside-Incorporación. Este vector se demostró la aptitud para exhibir cualitativa, la capacidad de escapar de sueros Ad5-positivo in vitro, y la antigenicidad, así como la inmunogenicidad de los antígenos incorporados.
Adenovirus de serotipo 5 (Ad5) ha sido ampliamente modificado con métodos tradicionales de transgén para el desarrollo de vacunas. Las eficacias reducidas de estos vectores Ad5 tradicionalmente modificados en los ensayos clínicos podrían ser correlacionados principalmente con Ad5 inmunidad pre-existente (PEI) entre la mayoría de la población. Promover el desarrollo de vacunas Ad5-vectored resolviendo la preocupación de Ad5 PEI, la innovadora estrategia de antígeno de la cápside-Incorporación se ha empleado. Por mérito de esta estrategia, Ad5 vectored-que primero construyó el transbordador hexón plásmido HVR1-Sus Kwas-HVR5-6 / pH5S subclonando la región hipervariable (HVR) 1 de hexón en un plásmido lanzadera previamente construido HVR5-His 6 / pH5S, que tenía Su etiqueta 6 incorporado en el HVR5. Se sintetizó Este fragmento de ADN que contiene un epítopo de HVR1 ELDKWAS VIH. 6 / pH5S Sus HVR1-Kwas-HVR5-Fue entonces linealizado y co-transformada con el plásmido linealizado backbone pAd5 / ΔH5 (GL),para la recombinación homóloga. Este plásmido recombinado pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5 6-His se transfectó en células para generar el vector viral Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5 6-His. Este vector fue validado para tener la aptitud cualitativa indica viral título física (VP / ml), título infeccioso (IP / ml) y la correspondiente relación / IP VP. Tanto el epítopo VIH y His 6 estaban en la cápside Ad5 expuesto en la superficie, y retenidos antigenicidad epítopo específico de los suyos. Un ensayo de neutralización indica la capacidad de este vector divalente para eludir la neutralización por sueros Ad5-positivo in vitro. Inmunización ratones demostró la generación de robusta inmunidad humoral específica al epítopo de VIH y su 6. Este estudio de prueba de principio sugirió que el protocolo asociado con la estrategia de antígeno de la cápside-Incorporación podría ser factible utilizar para la generación de vacunas vectorizadas-Ad5 mediante la modificación de diferentes proteínas de la cápside. Este protocolo podría incluso ser fás modificado para la generación de vacunas de adenovirus-vectorizada raras serotipo.
Adenovirus humano (Ad) es un virus de tamaño medio sin envoltura con una nucleocápside icosaédrica que contiene un genoma de ADN de cadena doble. Ad pertenece a la familia Adenoviridae, con una clasificación en siete grupos (A a G). Cada grupo contiene virus de diferentes serotipos. De los cuales, adenovirus serotipo 5 (Ad5) del grupo C ha sido el más estudiado y el que más se aplica para los enfoques vectored como la terapia génica y vacunas.
La estrategia transgén tradicional ha sido desarrollado y aplicado para las modificaciones de Ad5, que se caracteriza por el desplazamiento de los genes tempranos de virus con un gen de interés, y la expresión del gen de centrado de intereses en un huésped. Ejemplos de ello son la construcción de pENV9 / Ad5hrΔE3 mediante la sustitución de gen temprano 3 (E3) con el gen rev de Simian Virus de Inmunodeficiencia 1, la construcción de AdCMVGag mediante la sustitución de gen temprano 1 (E1) con el gen gag de la Inmunodeficiencia HumanaVirus (HIV) 2, y la construcción de Ad lac Z mediante la sustitución de E1 con lac Z gen 3. La amplia aplicación de la estrategia tradicional transgén en Ad5 depende de los siguientes méritos: la amplia gama de anfitriones para Ad5, la factible ingeniería gen en el virus y la propagación de virus, la gran alojamiento de inserto de gen extraño y la seguridad de Ad5 4,5. Sin embargo, los reducidos eficacias de terapias clínicas vectored-Ad5 por el uso de esta estrategia ha sido un importante cuello de botella, que ha sido asignada para ser asociado principalmente con Ad5 PEI, ya Ad5 es tan frecuente entre la mayoría de los niños y los adultos 4,6.
Para superar el principal cuello de botella de Ad5, el objetivo principal es el desarrollo de una estrategia alternativa eludir Ad5 PEI. La inmunidad innata 7, la inmunidad adaptativa, tales como anticuerpos neutralizantes (NABS), 8-10 y T CD8 + respuestas de las células 10 contra Ad5 se ha demostrado que contribute al Ad5 PEI, con Ad5 NAbs apareciendo a desempeñar el papel dominante en las contribuciones al Ad5 PEI 10,11. Por otra parte, Ad5 Nabs epítopos objetivo situadas en proteínas de la cápside, incluidos el principal hexón proteínas, fibra y base de pentón. De los cuales, hexón es el objetivo principal de Ad5 NAbs 8,11-13. Basándose en estos hallazgos, una innovadora estrategia de antígeno de la cápside-Incorporación se ha introducido. Esta nueva estrategia destaca la sustitución o incorporación de proteínas de intereses en las proteínas de la cápside Ad5, que desplaza o máscaras de los epítopos neutralizantes Ad5, que conduce a la disminución de reconocimiento por parte de las administraciones y NAbs vector Ad5 eficientes. Es de destacar que esta estrategia es competitivo ya que también puede ayudar a hosts provocar inmunidad humoral y la inmunidad celular robusto potente mediante la presentación de antígenos directamente-de-interés para el sistema inmune 4,14,15. Basado en esta estrategia, la clonación molecular y rescate Ad vector viral recombinante se pueden dividir estructuralmenteen cuatro pasos principales: (a) la preparación de fragmento de gen de interés ya sea por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o síntesis; (B) la ligación de fragmento de gen en un plásmido lanzadera que contiene el fragmento del gen de interés y los brazos homólogas a una cadena principal de adenovirus; (C) la recombinación homóloga por la co-transformación del plásmido lanzadera que contiene el fragmento del gen de intereses con el plásmido linealizado backbone pAd5 / ΔH5 (GL) 16; (D) la transfección de plásmido linealizado adenoviral recombinante para rescatar el vector Ad recombinante constituida con antígenos de intereses.
Nuestro grupo y algunos otros han extendido esta estrategia de incorporación de anuncio alternativo para Ad desarrollo de la vacuna vectorizada contra diferentes agentes patógenos infecciosos. Nos informó la generación de un vector recombinante Ad Ad-HVR1-LGS-Su 6 -V3 incorporando un Su-etiquetados VIH-1 antígeno V3 en la configuración regional HVR1 de Ad5 hexón (hexon5). Este vector generado desencadena strong respuesta inmune humoral específica para el epítopo V3 4. También informó el desarrollo de Ad5 / HVR2-MPER-L15ΔE1 incorporando el VIH-1 membrana región ectodominio proximal (MPER) en la configuración regional HVR2 de hexon5 2. Además, el grupo del Dr. Zhou ha utilizado los beneficios de esta estrategia de incorporación Ad desarrollar Ad serotipo 3 (Ad3) vacunas vectorizadas, es decir., La generación de vectores R1SP70A3 viral mediante la incorporación de un SP70 epítopo neutralizante de Enterovirus 71 en el HVR1 de Ad3 hexon (hexon3). R1SP70A3 generado NAbs fuertes y la producción de IFN-γ específicas para el epítopo SP70, que conducen a la alta tasa de protección contra Enterovirus 71 15 desafío.
A los efectos de referencia técnica, nuestro estudio se aprovechó de la estrategia de antígeno de la cápside-Incorporación cualitativa para centrarse en la generación de un vector Ad5 divalente Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-Su 6 mediante la incorporación de un antígeno del VIH-1 en HVR1 unda His en HVR5 de hexon5. El vector viral también fue generada inmunológicamente evaluado. La estrategia de antígeno de la cápside-Incorporación podría ser utilizado para el desarrollo de enfoques de vacunación vectored-Ad5 contra diferentes enfermedades infecciosas.
La aplicación de la estrategia tradicional transgén en la modificación de Ad5 para el desarrollo de vacunas se ha disminuido debido principalmente al cuello de botella asociado con el Ad5 PEI 4,6. Este cuello de botella puede ser parcialmente disminuido por la aplicación de la estrategia de antígeno de la cápside-Incorporación (Figura 1A) alternativo, ya que esta estrategia puede evadir la neutralización por Ad5 NAbs reemplazando neutralizantes epítopos de Ad5 con antígenos de inter…
The authors have nothing to disclose.
Esta obra fue financiada en parte por los Institutos Nacionales de Salud otorga 5T32AI7493-20 y 5R01AI089337-03. Los financiadores no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión de publicar, o la preparación del manuscrito.
1x DPBS | Thermo Scientific | SH30256.01 | for cell spliting |
10x DPBS | Thermo Scientific | SH30378.02 | for dialysis buffer preparation |
glycerol | SIGMA | G5516-1L | for dialysis buffer preparation |
SDS | BIO-RAD | 161-0301 | for virus lysis buffer preparation |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Scientific | SH30910.03 | component of culture medium |
100X Non-Essential Amino Acids | Thermo Scientific | SH30238.01 | component of culture medium |
200mM/L L-glutamine | Cellgro | 25-005-CI | component of culture medium |
penicillin/streptomycin solution | Cellgro | 30-002-CI | component of culture medium |
DMEM with high glucose | Thermo Scientific | SH30081.01 | for HEK293 cell culture |
Minimum Essential Medium Eagle | SIGMA | M5650 | for HeLa cell culture |
phenol:chloroform:isoamyl alcohol | SIGMA | P3803-100ML | for large size of DNA purification |
cesium chloride | Research Products International Corp. | C68050 | for virus purificiation |
HEPES | Cellgro | 25-060-CI | for CsCl solution preparation |
HEK293 | ATCC | 51-0036 | for virus rescue and upscale |
HeLa | ATCC | CCL-2 | for neutralization assay |
T-25 flask | Thermo Scientific | 156367 | for cell culture |
T-75 flask | CORNING | 430641 | for cell culture |
T-175 flask | Thermo Scientific | 159910 | for cell culture |
Ultracentrifuge | BECKMAN | NA | for virus purification |
Ultracentrifuge tube | BECKMAN | 344059 | for virus purification |
dialysis cassette | Thermo Scientific | 66380 | for virus dialysis |
ELISA plate | Thermo Scientific | 442404 | for ELISA |
human anti-gp41 (2F5) mAb | NIH AIDS Reagent Program | 1475 | for immunological assays |
mouse anti-His tag mAb | GenScript | A00186 | for immunological assays |
SOC medium | CORNING | 46-003-CR | for transformation |
PCR master mix solution | QIAGEN | 201445 | for PCR |
Animal lancet (point length at 5mm) | MEDIpoint | for mice bleeding | |
Biophotometer | Eppendorf | for virus physical titer titration |