Hier presenteren we een protocol om een proof-of-principle bivalente adenovirus type 5 (Ad5) vector genereren Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 door gebruik te maken van de Antigen Capsid-Incorporation strategie. Deze vector werd aangetoond kwalitatieve conditie vertonen het vermogen om Ad5-positieve sera in vitro, en de antigeniteit en immunogeniteit ontsnappen naar de opgenomen antigenen.
Adenovirus serotype 5 (Ad5) is uitgebreid gemodificeerd transgen met traditionele methoden voor vaccinontwikkeling. De verminderde efficacies deze traditioneel gemodificeerde Ad5 vectoren in klinische trials kon hoofdzakelijk worden gecorreleerd met reeds bestaande immuniteit Ad5 (PEI) onder de meerderheid van de bevolking. To-Ad5 vectored vaccin ontwikkeling te bevorderen door het oplossen van de bezorgdheid van Ad5 PEI, heeft het innovatieve Antigeen Capsid-Incorporation strategie toegepast. Door verdienste van deze strategie, Ad5-vectored we eerst gebouwd de hexon shuttle plasmide HVR1-KWAS-HVR5-His 6 / pH5S door subkloneren het hypervariabele gebied (HVR) 1 van hexon in een eerder opgebouwd shuttle plasmide HVR5-His 6 / pH5S, die moest Zijn 6-tag opgenomen in het HVR5. Deze HVR1 DNA-fragment dat een HIV epitoop ELDKWAS gesynthetiseerd. HVR1-KWAS-HVR5-His 6 / pH5S was toen lineair en co-getransformeerd met gelineariseerde backbone plasmide pAd5 / ΔH5 (GL),homologe recombinatie. Deze gerecombineerde plasmide pAd5 / H5-HVR1-KWAS HVR5-6-His werd getransfecteerd in cellen om de virale vector Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 genereren. Deze vector werd gevalideerd kwalitatieve conditie wordt aangegeven door virale titer fysische (VP / ml), infectieuze titer (IP / ml) en bijbehorende VP / IP ratio. Zowel de HIV-epitoop en Zijn 6-tag waren oppervlak blootgestelde op de Ad5 capside, en behield epitoopspecifieke antigeniciteit van hun eigen land. Een neutralisatietest vermeld het vermogen van deze divalente vector neutralisatie omzeilen door Ad5-positieve sera in vitro. Muizen immunisatie toonden de vorming van sterke humorale immuniteit specifiek voor het HIV epitoop en His 6. Deze studie proof-of-principle suggereerde dat het protocol in verband met het antigeen capside-Incorporation haalbare strategie kan worden toegepast voor de productie van Ad5-gevectoriseerd vaccins modificeren andere capside eiwitten. Dit protocol kan zelfs worden ferdere aangepast voor het genereren van zeldzame adenovirus serotype-gevectoriseerd vaccin.
Human adenovirus (Ad) is een middelgrote, niet-omhulde virus met een icosahedraal nucleocapside met een dubbelstrengs DNA-genoom. Ad behoort tot de familie Adenoviridae, met een indeling in zeven groepen (A tot G). Elke groep bevat virus van verschillende serotypen. Waarvan adenovirus serotype 5 (Ad5) uit groep C is het meest uitgebreid bestudeerd en de meest gevraagde vectored benaderingen zoals gentherapie en vaccinatie.
De traditionele transgen strategie ontwikkeld en toegepast voor Ad5 modificaties die wordt gekenmerkt door de verplaatsing van het virus vroege genen met een gen-van-belang en de gerichte expressie van het gen-van-belang in een gastheer. Voorbeelden zijn de aanleg van pENV9 / Ad5hrΔE3 door vervanging vroege gen 3 (E3) met rev-gen van Simian Immunodeficiency Virus 1, de opbouw van AdCMVGag door vervanging vroege gen 1 (E1) met het gag-gen van Human ImmunodeficiencyVirus (HIV) 2 en de constructie van Ad lacZ door vervanging E1 met lacZ gen 3. De brede toepassing van de traditionele transgene strategie op Ad5 afhankelijk van de volgende voordelen: het brede scala van gastheren voor Ad5, het haalbare gentechniek op virus en virus vermeerdering, de grote accommodatie van vreemd gen insert en de veiligheid van Ad5 4,5. De verminderde efficacies van Ad5-gevectoriseerd klinische therapieën met behulp van deze strategie is een belangrijk knelpunt, die is toegewezen aan voornamelijk geassocieerd met Ad5 PEI, aangezien Ad5 zo voorkomt onder de meeste kinderen en volwassenen 4,6.
Om de belangrijkste bottleneck van Ad5 te overwinnen, het primaire doel is om een alternatieve strategie te omzeilen Ad5 PEI ontwikkelen. Aangeboren immuniteit 7, adaptieve immuniteit zoals neutraliserende antilichamen (NAbs) 8-10 en CD8 + T cel responsen 10 tegen Ad5 is aangetoond dat contribute tot Ad5 PEI, met Ad5 NAbs verschijnen aan de dominante rol in de bijdragen spelen om Ad5 PEI 10,11. Bovendien Ad5 NAD doelepitopen in capside-eiwitten, waaronder de voornaamste eiwit hexon, fiber en penton basis. Waarvan, hexon is het belangrijkste doelwit van Ad5 NAbs 8,11-13. Gebaseerd op deze bevindingen, is een innovatieve Antigeen capside-Incorporation strategie ingevoerd. Deze nieuwe strategie benadrukt de vervanging of incorporatie van eiwitten-of-rente op Ad5 capsideproteïnen, die verschuift of maskeert de Ad5 neutraliserende epitopen, wat leidt tot de verminderde erkenning door de NAbs en efficiënte Ad5 vector administraties. Het is opmerkelijk dat deze strategie concurrerend omdat het kan ook helpen systemen wekken sterke humorale immuniteit en krachtige cellulaire immuniteit door direct presenteren antigenen-plaats aan het immuunsysteem 4,14,15. Op basis van deze strategie kan de moleculaire klonering en recombinante virale vector Ad rescue structureel verdeeldin vier hoofdstappen: (a) de bereiding van gen-plaats-fragment door een polymerase kettingreactie (PCR) of synthese; (B) het ligeren van het genfragment in een shuttle plasmide dat het fragment gen-plaats en homologe armen een adenovirus skelet bevat; (C) de homologe recombinatie door co-transformatie van de shuttle plasmide dat het gen-van-belang-fragment met de gelineariseerde plasmide backbone pAd5 / ΔH5 (AR) 16; (D) de transfectie van lineair recombinante adenovirale plasmide aan de recombinante Ad vector opgenomen met antigenen-of-interest redden.
Onze groep en enkele anderen hebben deze alternatieve Ad integratie strategie voor Ad vectored ontwikkeling van vaccins tegen verschillende besmettelijke ziekteverwekkers verlengd. We meldden het genereren van een recombinante Ad vector Ad-HVR1-LGS-His 6-V3 doordat een His-gemerkte HIV-1 antigen V3 in het HVR1 locale van Ad5 hexon (hexon5). Dit gegenereerde vector geactiveerd strong humorale immuunrespons specifiek voor de V3 epitoop 4. We meldden ook de ontwikkeling van Ad5 / HVR2-MPER-L15ΔE1 door het opnemen van HIV-1 membraanproximale ectodomain gebied (MPER) in de HVR2 locale van hexon5 2. Daarnaast heeft het team van Dr. Zhou de voordelen van deze Ad opneming strategie gebruikt om Ad serotype 3 (Ad3) gevectoriseerd vaccins ie. Ontwikkelt, de vorming van virale vector R1SP70A3 doordat een neutraliserende epitoop SP70 enterovirus 71 in het HVR1 van Ad3 hexon (hexon3). R1SP70A3 gegenereerde sterke NAbs en IFN-γ productie specifiek voor het epitoop SP70, die leiden tot het hoge percentage bescherming tegen Enterovirus 71 15 challenge.
Voor de toepassing van technische referentie, onze studie maakte gebruik van de kwalitatieve Antigeen Capsid-Incorporation strategie om zich te concentreren op het genereren van een divalent Ad5 vector Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 door het opnemen van een HIV-1-antigeen in HVR1 eenda Zijn tag in HVR5 van hexon5. De gegenereerde virale vector werd immunologisch onderzocht. Het antigeen capside-Incorporation strategie kan worden toegepast voor de ontwikkeling van Ad5-gevectoriseerd vaccinatie benaderingen tegen verschillende infectieziekten.
De toepassing van de traditionele transgen strategie Ad5 modificatie voor de ontwikkeling van vaccins is afgenomen voornamelijk door de bottleneck in verband met de Ad5 PEI 4,6. Dit knelpunt kan gedeeltelijk worden verminderd door toepassing van de alternatieve Antigeen Capsid-Incorporation strategie (figuur 1A), aangezien deze strategie neutralisatie kan omzeilen door Ad5 NAbs door het vervangen van neutraliserende epitopen van Ad5 met antigenen-of-interest, en het genereren van robuuste imm…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd mede ondersteund door de National Institutes of Health verleent 5T32AI7493-20 en 5R01AI089337-03. De financiers hadden geen rol in de onderzoeksopzet, het verzamelen en analyseren van gegevens, het besluit te publiceren, of de bereiding van het manuscript.
1x DPBS | Thermo Scientific | SH30256.01 | for cell spliting |
10x DPBS | Thermo Scientific | SH30378.02 | for dialysis buffer preparation |
glycerol | SIGMA | G5516-1L | for dialysis buffer preparation |
SDS | BIO-RAD | 161-0301 | for virus lysis buffer preparation |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Scientific | SH30910.03 | component of culture medium |
100X Non-Essential Amino Acids | Thermo Scientific | SH30238.01 | component of culture medium |
200mM/L L-glutamine | Cellgro | 25-005-CI | component of culture medium |
penicillin/streptomycin solution | Cellgro | 30-002-CI | component of culture medium |
DMEM with high glucose | Thermo Scientific | SH30081.01 | for HEK293 cell culture |
Minimum Essential Medium Eagle | SIGMA | M5650 | for HeLa cell culture |
phenol:chloroform:isoamyl alcohol | SIGMA | P3803-100ML | for large size of DNA purification |
cesium chloride | Research Products International Corp. | C68050 | for virus purificiation |
HEPES | Cellgro | 25-060-CI | for CsCl solution preparation |
HEK293 | ATCC | 51-0036 | for virus rescue and upscale |
HeLa | ATCC | CCL-2 | for neutralization assay |
T-25 flask | Thermo Scientific | 156367 | for cell culture |
T-75 flask | CORNING | 430641 | for cell culture |
T-175 flask | Thermo Scientific | 159910 | for cell culture |
Ultracentrifuge | BECKMAN | NA | for virus purification |
Ultracentrifuge tube | BECKMAN | 344059 | for virus purification |
dialysis cassette | Thermo Scientific | 66380 | for virus dialysis |
ELISA plate | Thermo Scientific | 442404 | for ELISA |
human anti-gp41 (2F5) mAb | NIH AIDS Reagent Program | 1475 | for immunological assays |
mouse anti-His tag mAb | GenScript | A00186 | for immunological assays |
SOC medium | CORNING | 46-003-CR | for transformation |
PCR master mix solution | QIAGEN | 201445 | for PCR |
Animal lancet (point length at 5mm) | MEDIpoint | for mice bleeding | |
Biophotometer | Eppendorf | for virus physical titer titration |