Aqui, apresentamos um protocolo para gerar um bivalente adenovírus tipo 5 (Ad5) vector de prova de princípio Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6, utilizando a estratégia de antígeno do capsídeo-Incorporação. Este vector foi demonstrado que exibem aptidão qualitativa, a capacidade de escapar soros Ad5-positiva, in vitro, e a antigenicidade, bem como a imunogenicidade dos antigénios incorporados.
O adenovírus serotipo 5 (Ad5) tem sido extensivamente modificado com métodos tradicionais de transgenes para o desenvolvimento de vacinas. As eficiências reduzidas destes vectores Ad5 tradicionalmente modificados em ensaios clínicos que se correlacionam principalmente com Ad5 imunidade pré-existente (PEI) entre a maioria da população. Para promover o desenvolvimento da vacina vetorizada-Ad5, resolvendo a preocupação de Ad5 PEI, tem sido utilizada a inovadora estratégia de antígeno do capsídeo-Incorporação. Por mérito desta estratégia, Ad5-vectored que primeiro construiu o shuttle hexon plasmídeo HVR1-Seus Kwas-HVR5-6 / pH5S por subclonagem da região hipervariável (HVR) 1 de hexon num plasmídeo de transporte previamente construído HVR5-His 6 / pH5S, que tinha Sua 6 tag incorporada no HVR5. Este fragmento de DNA contendo um epitopo HVR1 ELDKWAS HIV foi sintetizado. 6 / pH5S Seus HVR1-Kwas-HVR5-se então linearizado e co-transformada com o plasmídeo linearizado pAd5 backbone / ΔH5 (GL),para recombinação homóloga. Este plasmídeo recombinado pAd5 / H5-HVR1-Kwas HVR5-6-His foi transfectado em células para gerar o vector viral Ad5 / H5-HVR1-Kwas HVR5-6-His. Este vector foi validado para ter aptidão qualitativa indicado pelo título viral física (VP / ml), título infeccioso (IP / ml) e correspondente rácio / IP VP. Tanto o epitopo HIV e Sua 6 tag foram sobre a cápside de Ad5 expostos à superfície, e manteve-epítopo específico antigenicidade da sua própria. Um ensaio de neutralização indicada a capacidade deste vector para contornar divalente de neutralização pelo soro de Ad5-positiva, in vitro. A imunização de camundongos demonstraram a geração de robusta imunidade humoral específica para o epitopo HIV e Sua 6. Este estudo de prova de princípio sugerido que o protocolo associado com a estratégia de antigénio da cápside-Incorporação poderia ser viável utilizado para a geração de vacinas de Ad5-vectored diferentes, modificando as proteínas da cápside. Este protocolo poderia até ser futros modificado para a geração de rara do serotipo vacinas em vector-adenovírus.
Adenovírus humano (Ad) é, um vírus de tamanho médio não encapsulado com uma nucleocápside icosaédrica que contém um genoma de ADN de cadeia dupla. Ad pertence à família Adenoviridae, com uma classificação em sete grupos (A a G). Cada grupo contém vírus de diferentes serótipos. Dos quais, adenovírus serotipo 5 (Ad5) do grupo C tem sido o mais extensamente estudado e o mais amplamente aplicado para abordagens vectored como terapia genética e vacinação.
A estratégia transgene tradicional tem sido desenvolvido e aplicado para modificações de Ad5, que se caracteriza por o deslocamento dos genes precoces do vírus com um gene de interesse, e a expressão do gene focado de interesse num hospedeiro. Exemplos são a construção de pENV9 / Ad5hrΔE3 por substituição do gene inicial 3 (E3) com o gene rev de Simian Vírus da Imunodeficiência 1, a construção de AdCMVGag através da substituição do gene precoce 1 (E1) com o gene gag de Imunodeficiência HumanaVirus (HIV) 2, e a construção de lac Z por Ad substituindo E1 com o gene lac Z 3. A ampla aplicação da estratégia tradicional transgene em Ad5 depende dos seguintes méritos: a ampla gama de hospedeiros para Ad5, a engenharia genética viável sobre o vírus e propagação de vírus, o grande alojamento de inserção de genes estranhos ea segurança de Ad5 4,5. No entanto, as eficiências reduzidas de terapias clínicas Ad5-vectored por utilização desta estratégia tem sido um importante ponto de estrangulamento, que tem sido mapeada para ser associado principalmente com Ad5 PEI, uma vez que o Ad5 é tão prevalente entre a maioria de crianças e adultos 4,6.
Para vencer o principal estrangulamento de Ad5, o objetivo principal é desenvolver uma estratégia alternativa contornar Ad5 PEI. A imunidade inata 7, a imunidade adaptativa, tais como anticorpos neutralizantes (NAbs) 8-10 e CD8 + T respostas de células 10 contra Ad5 têm sido mostrados para contribute ao Ad5 PEI, com Ad5 NAbs aparecendo para desempenhar o papel dominante nas contribuições para Ad5 PEI 10,11. Além disso, Ad5 NABS epítopos alvo situadas em proteínas do capsídeo, incluindo o principal hexon proteínas, fibras e base penton. Dos quais, hexon é o principal alvo de Ad5 NAbs 8,11-13. Com base nestes resultados, uma estratégia de incorporação de antigénio da cápside inovadora foi introduzida. Esta nova estratégia destaca a substituição ou incorporação de proteínas-de-juros sobre proteínas do capsídeo de Ad5, que desloca ou mascara os epítopos neutralizantes Ad5, levando à diminuição do reconhecimento pelo NAbs e eficientes administrações vetor Ad5. É de salientar que esta estratégia é competitivo, porque ele também pode ajudar anfitriões provocar imunidade humoral robusta e imunidade celular potente diretamente por apresentar antígenos de interesse para o sistema imunológico 4,14,15. Com base nesta estratégia, a clonagem molecular e salvamento recombinante Ad vetor viral pode ser estruturalmente divididaem quatro etapas principais: (a) a preparação de fragmento do gene de interesse por qualquer reação em cadeia da polimerase (PCR) ou síntese; (B) a ligação do fragmento do gene num plasmídeo de transporte que contém o fragmento do gene de interesse e os braços homólogas a uma espinha dorsal adenovírus; (C) a recombinação homóloga por co-transformação do plasmideo de transporte contendo o fragmento do gene de interesse com a espinha dorsal do plasmídeo linearizado pAd5 / ΔH5 (GL) 16; (D) a transfecção de plasmídeo linearizado adenovírus recombinante para resgatar o vector Ad recombinante incorporado com antigénios-de-interesse.
O nosso grupo e alguns outros já estendeu essa estratégia alternativa incorporação anúncio para Ad desenvolvimento da vacina vetorizada contra diferentes agentes infecciosos. Nós relataram a geração de um vector Ad recombinantes Ad-HVR1-LGS-His 6 -v3 por incorporação de um marcada com His de HIV-1 de antigénio para a região V3 de Ad5 HVR1 hexon (hexon5). Este vector gerado desencadeada strong resposta imunitária humoral específica para o epítopo V3 4. Também relatou o desenvolvimento de Ad5 / HVR2-MPER-L15ΔE1 através da incorporação de HIV-1 de membrana região ectodom�io proximal (MPER) na localidade de HVR2 hexon5 2. Além disso, o grupo do Dr. Zhou utilizou os benefícios desta estratégia de incorporação de anúncios para desenvolver serotipo ad 3 (Ad3) vacinas vetoriais, isto é., A geração do vector viral R1SP70A3 por incorporação de um epitopo neutralizante de SP70 Enterovírus 71 na HVR1 de Ad3 hexon (hexon3). R1SP70A3 gerado NAbs fortes e produção de IFN-γ específicos para o epitopo SP70, que levam à alta taxa de protecção contra o desafio 15 71 Enterovírus.
Para efeitos de referência técnica, nosso estudo se aproveitou da estratégia de antígeno do capsídeo-Incorporação qualitativa para se concentrar na geração de um bivalente Ad5 vetor Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6, incorporando um antígeno HIV-1 em HVR1 umda sua tag em HVR5 de hexon5. O vector viral gerada foi também avaliada imunologicamente. A estratégia de antigénio da cápside-A incorporação pode ser utilizada para o desenvolvimento de abordagens de vacinação contra o Ad5-vectored doenças infecciosas diferentes.
A aplicação da estratégia do transgene tradicional em Ad5 modificação para o desenvolvimento de vacinas tem sido diminuído, principalmente devido ao estrangulamento associada com o Ad5 de PEI 4,6. Este gargalo pode ser parcialmente diminuída pela aplicação da estratégia alternativa antígeno do capsídeo-Incorporation (Figura 1A), uma vez que esta estratégia pode fugir neutralização por Ad5 NAbs substituindo neutralizantes epítopos de Ad5 com antígenos-de-interesse, e facilitar…
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado em parte pelo National Institutes of Health concede 5T32AI7493-20 e 5R01AI089337-03. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito.
1x DPBS | Thermo Scientific | SH30256.01 | for cell spliting |
10x DPBS | Thermo Scientific | SH30378.02 | for dialysis buffer preparation |
glycerol | SIGMA | G5516-1L | for dialysis buffer preparation |
SDS | BIO-RAD | 161-0301 | for virus lysis buffer preparation |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Scientific | SH30910.03 | component of culture medium |
100X Non-Essential Amino Acids | Thermo Scientific | SH30238.01 | component of culture medium |
200mM/L L-glutamine | Cellgro | 25-005-CI | component of culture medium |
penicillin/streptomycin solution | Cellgro | 30-002-CI | component of culture medium |
DMEM with high glucose | Thermo Scientific | SH30081.01 | for HEK293 cell culture |
Minimum Essential Medium Eagle | SIGMA | M5650 | for HeLa cell culture |
phenol:chloroform:isoamyl alcohol | SIGMA | P3803-100ML | for large size of DNA purification |
cesium chloride | Research Products International Corp. | C68050 | for virus purificiation |
HEPES | Cellgro | 25-060-CI | for CsCl solution preparation |
HEK293 | ATCC | 51-0036 | for virus rescue and upscale |
HeLa | ATCC | CCL-2 | for neutralization assay |
T-25 flask | Thermo Scientific | 156367 | for cell culture |
T-75 flask | CORNING | 430641 | for cell culture |
T-175 flask | Thermo Scientific | 159910 | for cell culture |
Ultracentrifuge | BECKMAN | NA | for virus purification |
Ultracentrifuge tube | BECKMAN | 344059 | for virus purification |
dialysis cassette | Thermo Scientific | 66380 | for virus dialysis |
ELISA plate | Thermo Scientific | 442404 | for ELISA |
human anti-gp41 (2F5) mAb | NIH AIDS Reagent Program | 1475 | for immunological assays |
mouse anti-His tag mAb | GenScript | A00186 | for immunological assays |
SOC medium | CORNING | 46-003-CR | for transformation |
PCR master mix solution | QIAGEN | 201445 | for PCR |
Animal lancet (point length at 5mm) | MEDIpoint | for mice bleeding | |
Biophotometer | Eppendorf | for virus physical titer titration |