여기서는 원리 증명 가의 아데노 바이러스 타입 5 (의 Ad5) 벡터를 생성하는 프로토콜을 제시의 Ad5 / H5-HVR1-KWAS HVR5-6-그의 항원 캡시드 혼입 전략을 이용하여. 이 벡터는 성적 체력을 나타내는 것으로 입증되었다, 기능은 통합 항원의 Ad5 양성 시험관 내에서 혈청 및 항원뿐만 아니라 면역 원성을 탈출.
아데노 바이러스 혈청 형 5 (의 Ad5)를 광범위하게 백신 개발을위한 기존의 형질 전환 방법으로 수정되었습니다. 임상 시험 전통적으로 이러한 변형 된 Ad5 벡터의 감소 효능은 주로 인구 중 대다수의 Ad5 기존 면역성 (PEI)과 상관 될 수있다. 의 Ad5 PEI의 우려를 해결하여의 Ad5-벡터화 백신 개발을 촉진하기 위해, 혁신적인 항원 캡시드-설립 전략은 사용되어왔다. 이 전략의 장점으로, 우리가 처음 hexon 셔틀 건설의 Ad5가-벡터화 플라스미드 HVR1-KWAS-HVR5 – 그 이전에 건설 셔틀 플라스미드 HVR5-그의 6 / pH5S에 가변 영역 (HVR) hexon의 1 서브 클로닝하여 6 / pH5S, 그의 6 태그 HVR5에 통합했다있다. HIV 에피토프를 함유 ELDKWAS HVR1이 DNA 단편을 합성 하였다. HVR1-KWAS-HVR5-그의 6 / pH5S 후 선형 및 선형 백본 플라스미드 pAd5 / ΔH5 (GL)와 공동으로 형질 전환상동 재조합합니다. pAd5가 / H5는-HVR1이-KWAS-HVR5이-그의 6 세포로 형질 전환 된이 재조합 플라스미드는 바이러스 벡터의 Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-그의 6을 생성합니다. 이 벡터는 실제 바이러스 역가 (VP / ㎖)로 표시 질적 니스 전염성 역가 (IP / ㎖) 및 대응 VP / IP 비율을 갖도록 검증 하였다. 모두 HIV 에피토프와 그의 6 태그는 표면에 노출 된 Ad5 캡시드에 있었고, 자신의 에피토프 특정 항원을 유지했다. 중화 분석은 시험 관내에서의 Ad5 양성 혈청에 의해 중화를 우회하기 위해이 가의 벡터의 능력을 나타내었다. 마우스 예방 접종은 HIV 에피토프 6 그분에 강력한 체액 성 면역 특정의 생성을 보여 주었다. 이 원리 증명 연구 캡시드 항원 혼입 전략과 연관된 프로토콜을 실행 가능하게 상이한 캡시드 단백질을 수정의 Ad5-벡터화 백신의 생성을 위해 이용 될 수 있다고 제안했다. 이 프로토콜은 심지어 수 f를urther 희토류 혈청 형 아데노 – 벡터화 백신의 생성을위한 개질.
인간 아데노 바이러스 (AD)는 이중 가닥 DNA 게놈을 포함하는 뉴 클레오 캡시드 면체와 중형, 비 – 외피 바이러스이다. 광고는 일곱 그룹으로 분류 (G 통해)와, 아데노 바이러스 제품군에 속한다. 각 그룹은 다른 혈청 형의 바이러스가 포함되어 있습니다. 그룹 C에서, 아데노 바이러스, 이는 혈청 형 5의 (의 Ad5)의 가장 광범위하게 연구되어 왔으며 가장 널리 유전자 치료 백신과 같은 벡터화에 대한 적용 방법.
전통적인 유전자 전략 개발 및 유전자의 관심을 가진 바이러스 초기 유전자의 변위 특징으로 된 Ad5 변형, 적용, 및 유전자의 관심 숙주에서의 발현 집중되었다. 예를 들면 유인원 면역 결핍 바이러스 1 회전 유전자 초기 유전자 3 (E3)을 대체하여 pENV9 / Ad5hrΔE3의 건설이다, 인간 면역 결핍의 개그 유전자 초기 유전자 1 (E1)을 대체하여 AdCMVGag의 건설바이러스 (HIV) 2, 락 Z 유전자 3 (E1)를 교체하여 광고 락 Z의 건설. 의 Ad5에 전통적인 유전자 전략의 광범위한 애플리케이션은 다음의 장점에 의존의 Ad5, 바이러스 및 바이러스 증식에 가능한 유전자 공학, 외래 유전자 삽입의 대형 숙박 시설과의 Ad5 4,5의 안전을 위해 호스트 다양한. 그러나,이 전략을 이용하여 벡터화 된 Ad5-임상 치료의 감소는 효능의 Ad5 어린이와 어른의 4,6- 중 대다수 만연해 때문에, 주로의 Ad5 PEI과 연관 매핑 된 주요 병목왔다.
의 Ad5의 주요 병목 현상을 극복하기 위해, 주요 목적은 PEI의 Ad5를 우회 대체 전략을 개발하는 것이다. 이러한 중화 항체 (NABS) 8-10 및 CD8 + T 세포 반응 등의 선천성 면역 7, 적응 면역이의 Ad5에 대하여 (10)는 공동 것으로 나타났다의 Ad5 NABS가의 Ad5 PEI 10, 11에 기여에서 지배적 인 역할을 할 것으로 나타나는으로의 Ad5 PEI에 ntribute. 또한,의 Ad5의 주요 단백질 hexon, 섬유 및 펜톤 기본 포함 캡시드 단백질에있는 대상 에피토프를, NABS. 그중 hexon는의 Ad5 NABS 8,11-13의 주요 대상입니다. 이러한 발견에 기초하여, 혁신적인 캡시드 항원 혼입 전략이 도입되었다. 이 새로운 전략은 NABS하고 효율적인의 Ad5 벡터 행정에 의해 감소 된 인식으로 이어지는, 단백질-의 관심의 Ad5 중화 에피토프를 이동 또는 마스크의 Ad5 캡시드 단백질에의 교체 또는 통합을 강조한다. 그것은 또한 호스트가 직접 면역 시스템 4,14,15 항원에 관심 – 제시하여 강력한 체액 성 면역 및 세포 면역 효능을 유도 할 수 있기 때문에 도움이 전략이 경쟁력 있음을 주목할 만하다. 이러한 전략에 기초하여, 분자 클로닝 및 재조합 바이러스 벡터 광고 구조는 구조적으로 분할 될 수있다네 가지 주요 단계로, (a) 중 중합 효소 연쇄 반응 (PCR) 또는 합성에 의해 유전자의 관심 단편의 제조; (b) 아데노 백본 유전자 단편의 관심과 상 동성 암을 포함하는 셔틀 플라스미드 내로 유전자 단편의 라이 게이션; (c)에 의한 상동 재조합 공동 바뀌는 선형화 된 플라스미드 백본 pAd5 / ΔH5 (GL) 16 유전자의 관심 단편을 포함하는 셔틀 플라스미드; (D) 선형화 재조합 아데노 바이러스 플라스미드의 형질은 항원 – 중 – 관심 통합 재조합 광고 벡터를 구출한다.
우리 그룹과 일부 다른 사람은 다른 감염성 병원균에 대한 광고 벡터화 백신 개발이 대안 광고의 통합 전략을 드리고 있습니다. 우리는 재조합 광고 벡터의 생성을보고 광고 – HVR1-LGS-자신의 Ad5의 hexon (hexon5)의 HVR1 로케일로 그의 태그가 HIV-1 항원 (V3)을 통합하여 6 -V3. 이 생성 된 벡터는 STR 트리거V3 에피토프 4 특정 옹 체액 성 면역 반응. 우리는 또한 hexon5 2의 HVR2 로케일로 HIV-1 막 인접 ectodomain 영역 (MPER)를 통합하여의 Ad5 / HVR2-MPER-L15ΔE1의 개발을보고했다. 또한, 닥터 서주의 그룹 애드 혈청 형 3 (AD3) 벡터화 백신, 즉. 개발이 광고 혼입 전략의 장점을 사용한, AD3의 HVR1으로 엔테로 바이러스 71의 중화 에피토프 SP70을 통합하여 바이러스 벡터 R1SP70A3의 세대 hexon (hexon3). R1SP70A3은 엔테로 바이러스 (71) 도전 (15)에 대한 보호의 높은 비율로 이어질 에피토프 SP70에 특정 강한 NABS 및 IFN-γ 생산을 생성.
기술 참조의 목적을 위해, 우리의 연구는 HVR1에 HIV-1 항원을 통합하여 가의의 Ad5 벡터의 Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-그의 6의 생성에 초점을 질적 항원 캡시드-설립 전략을 이용했다다 hexon5의 HVR5에 자신의 태그입니다. 생성 된 바이러스 벡터는 또한 면역 학적으로 평가 하였다. 항원 캡시드-설립 전략은 다른 감염성 질병에 대한의 Ad5-벡터화 예방 접종 방법의 발전으로 활용 될 수있다.
백신의 개발을위한 변형 된 Ad5에 전통적인 유전자 전략의 애플리케이션은 주로 기인 된 Ad5 PEI 4,6-와 연관된 병목 감소되었다. 이 병목 현상은 부분적으로이 전략의 Ad5 NABS에 의해 중화을 회피 할 수 있기 때문에 항원 – 중 – 관심의 Ad5의 중화 에피토프를 대체하여, 다른 항원 캡시드-설립 전략 (그림 1A)의 응용 프로그램에 의해 감소하고, 강력한 면역의 생성을 촉진 할 수있다 ?…
The authors have nothing to disclose.
건강 5T32AI7493-20과 5R01AI089337-03 부여의이 작품은 국립 연구소에 의해 부분적으로 지원되었다. 자금 제공자는 연구 설계, 자료 수집 및 분석, 게시하는 결정, 또는 원고의 준비를 전혀 역할을 없었다.
1x DPBS | Thermo Scientific | SH30256.01 | for cell spliting |
10x DPBS | Thermo Scientific | SH30378.02 | for dialysis buffer preparation |
glycerol | SIGMA | G5516-1L | for dialysis buffer preparation |
SDS | BIO-RAD | 161-0301 | for virus lysis buffer preparation |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Scientific | SH30910.03 | component of culture medium |
100X Non-Essential Amino Acids | Thermo Scientific | SH30238.01 | component of culture medium |
200mM/L L-glutamine | Cellgro | 25-005-CI | component of culture medium |
penicillin/streptomycin solution | Cellgro | 30-002-CI | component of culture medium |
DMEM with high glucose | Thermo Scientific | SH30081.01 | for HEK293 cell culture |
Minimum Essential Medium Eagle | SIGMA | M5650 | for HeLa cell culture |
phenol:chloroform:isoamyl alcohol | SIGMA | P3803-100ML | for large size of DNA purification |
cesium chloride | Research Products International Corp. | C68050 | for virus purificiation |
HEPES | Cellgro | 25-060-CI | for CsCl solution preparation |
HEK293 | ATCC | 51-0036 | for virus rescue and upscale |
HeLa | ATCC | CCL-2 | for neutralization assay |
T-25 flask | Thermo Scientific | 156367 | for cell culture |
T-75 flask | CORNING | 430641 | for cell culture |
T-175 flask | Thermo Scientific | 159910 | for cell culture |
Ultracentrifuge | BECKMAN | NA | for virus purification |
Ultracentrifuge tube | BECKMAN | 344059 | for virus purification |
dialysis cassette | Thermo Scientific | 66380 | for virus dialysis |
ELISA plate | Thermo Scientific | 442404 | for ELISA |
human anti-gp41 (2F5) mAb | NIH AIDS Reagent Program | 1475 | for immunological assays |
mouse anti-His tag mAb | GenScript | A00186 | for immunological assays |
SOC medium | CORNING | 46-003-CR | for transformation |
PCR master mix solution | QIAGEN | 201445 | for PCR |
Animal lancet (point length at 5mm) | MEDIpoint | for mice bleeding | |
Biophotometer | Eppendorf | for virus physical titer titration |