Determinazione Membrane Protein Topologia Usando fluorescenza Protease Protection (FPP)

Summary

Here, we present a protocol to determine the orientation and topology of integral membrane proteins in living cells. This simple protocol relies on selective protease sensitivity of chimeras between the protein of interest and GFP.

Abstract

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established for many membrane proteins. A simple technique called fluorescence protease protection (FPP) is presented, which permits the determination of membrane protein topology in living cells. This technique has numerous advantages over other methods for determining protein topology, in that it does not require the availability of multiple antibodies against various domains of the membrane protein, does not require large amounts of protein, and can be performed on living cells. The FPP method employs the spatially confined actions of proteases on the degradation of green fluorescent protein (GFP) tagged membrane proteins to determine their membrane topology and orientation. This simple approach is applicable to a wide variety of cell types, and can be used to determine membrane protein orientation in various subcellular organelles such as the mitochondria, Golgi, endoplasmic reticulum and components of the endosomal/recycling system. Membrane proteins, tagged on either the N-termini or C-termini with a GFP fusion, are expressed in a cell of interest, which is subject to selective permeabilization using the detergent digitonin. Digitonin has the ability to permeabilize the plasma membrane, while leaving intracellular organelles intact. GFP moieties exposed to the cytosol can be selectively degraded through the application of protease, whereas GFP moieties present in the lumen of organelles are protected from the protease and remain intact. The FPP assay is straightforward, and results can be obtained rapidly.

Introduction

Le membrane plasmatiche, nonché numerose membrane intracellulari, servono come barriere che separano due compartimenti acquosi. Nel caso della membrana plasmatica, la separazione è tra l'esterno e l'interno della cella; per organelli intracellulari che è tra il citoplasma e il lume organelli. Ad esempio, la membrana del reticolo endoplasmatico (ER) separa un ambiente ossidante all'interno del lume del ER da un citosolico riducendo ambiente ^1. Le proteine ​​di membrana sono sintetizzate sui ribosomi ER-associata, e raggiungere il loro topologia finale entro la membrana ER ^2. L'acquisizione di un adeguato orientamento membrane e topologia per le proteine ​​è fondamentale per la loro normale funzione. Topologia corretta permette pertinenti domini di proteine ​​di membrana per interagire con i partner di legame, permette critici modificazioni post-traduzionali a verificarsi, e nel caso delle proteine ​​di membrana di plasma, permette alla cellula di interagire con e rispondere to suo ambiente. Per apprezzare appieno la funzione di una proteina di membrana, è chiaramente indispensabile sapere come tale proteina è orientato rispetto alla membrana entro cui risiede, cioè la sua topologia membrana. Oltre alla acquisizione di conoscenze scientifiche di base, comprendere la topologia di una proteina di membrana e quali aspetti di una superficie proteine ​​sono esposte ad ambienti differenti ha segnato implicazioni cliniche poiché proteine ​​di membrana sono la maggioranza dei bersagli farmacologici ^3. Fino a poco tempo, approcci per determinare la topologia di proteine ​​di membrana hanno richiesto un notevole investimento di tempo e di denaro o hanno richiesto reagenti che sono difficili da trovare.

Sia approcci sperimentali e in silico sono stati impiegati per determinare la topologia di proteine ​​di membrana che risiedono all'interno della membrana plasmatica. Dal momento che le prime previsioni di domini di membrana attraversa basati sulla idrofobicità valutato di indiviaminoacidi doppio ^3, numerosi algoritmi predittivi sono ora disponibili su internet, e semplicemente richiedono la conoscenza della sequenza aminoacidica della proteina. Tuttavia, le ipotesi sono spesso al centro di tali programmi di modellazione, ipotesi che possono portare alle assegnazioni errate di topologia ^4,5. Inoltre, mentre le previsioni basate su computer è possibile assegnare provvisoriamente le regioni che vanno a membrana, che non sempre determinano se la amino o carbossi-terminale di proteine ​​sono nel citoplasma, lume organelli o esterno cella. Anche con maggiore potenza di calcolo, e l'uso di algoritmi di apprendimento macchina ^6, tali dati è ancora un modello, e deve essere convalidato utilizzando i dati acquisiti sperimentalmente. Determinazione diretta sperimentale di topologia di membrana è stata effettuata utilizzando pannelli di anticorpi monoclonali con epitopi noti distribuite in tutta la proteina, in cui è stata effettuata la valutazione della loro immunoreattività prima e dopo permeabilizzazione cellulare. Questoapproccio richiede una serie di anticorpi, che non possono essere disponibili per la proteina di interesse.

Una strategia alternativa è quella di progettare etichette epitopi quali myc o emoagglutinina (HA) in varie località in tutta la proteina, ancora una volta seguita da determinazione della immunoreattività prima e dopo permeabilizzazione della membrana. Oltre ai tag immunogenico, tag enzimatici (compresi fosfatasi alcalina, β-galattosidasi, o β-lattamasi) e modificazioni chimiche come la scansione cisteina sono stati tutti impiegati per determinare membrana proteica topologia ^7,8. Un ulteriore metodo impiegato per la mappatura topologica delle proteine ​​di membrana plasmatica si basa su un approccio leggermente diverso per tag epitopi. In questo metodo la sequenza di tag è la sequenza di consenso glicosilazione N-linked NXS / T. Poiché glicosilazione avviene solo quando tale sequenza è presente nel lume della via biosintetica, la presenza del tag in un luminale controun compartimento citosolico è facile osservare come spostamento di massa su gel SDS-PAGE. Tale approccio è stato applicato al canale ionico multispanning CFTR ^9. Mentre tutti questi approcci sono stati utilizzati, è chiaro che tutti richiedono notevoli investimenti nel campo della biologia molecolare per generare e la sequenza dei costrutti molteplici.

Per determinare le informazioni topologiche riguardanti proteine ​​transmembrana situati all'interno organelli intracellulari ha dimostrato di essere più impegnativo. L'applicazione di tecnologie basate fluorescenza tuttavia, ha fatto la determinazione della topologia di membrana molto più semplice. La tecnica di bimolecolare fluorescenza complementazione (BiFC) si basa sulla interazione tra due frammenti non fluorescenti di una proteina fluorescente, ripristinando le proprietà fluorescenti di quella proteina ^10. Sebbene inizialmente descritto per determinare le interazioni proteina-proteina in vivo ^10, questo approccio è anche stato utilizzatoper determinare membrana proteica topologia nelle cellule vegetali ^11. Tuttavia questo approccio è anche tempo intenso in quanto richiede la generazione non solo di proteine ​​di fusione con la proteina di interesse, ma anche una varietà di proteine ​​di fusione mirati al citosol o organelli lume, e richiede la cui conoscenza intracellulare membrane proteina di interesse risiede in .

Un approccio alternativo alla semplice determinazione topologia proteina di membrana è stato descritto ^12. Il saggio di fluorescenza proteasi protezione (FPP) richiede la generazione di una proteina di fusione tra GFP e il gene di interesse. L'approccio è basato sulla relativa accessibilità di proteasi non specifici per la frazione GFP; a seconda che GFP è protetto dalla proteolisi risiedendo nel lume di organelli intracellulari o è esposto alla proteolisi essendo presenti nel citosol. Pertanto, se la frazione GFP sulla proteina di interesse affaccia citoplasma, sarà esposto aattività proteasica e il segnale di fluorescenza persi. Al contrario, se la frazione GFP sulla proteina di interesse affaccia un ambiente 'protetto' dalla proteasi (come il lume Golgi) allora il segnale di fluorescenza persisterà.

Per consentire proteasi di entrare nella cellula, ma non immettere compartimenti intracellulari membrana farmaco vincolante colesterolo digitonina viene utilizzato. Il colesterolo è sterolo dominante in vertebrati, ed è specificamente arricchito nella membrana plasmatica rispetto al compartimenti intracellulari. La tossina glicoside, digitonina, viene estratto dalla pianta Digitalis purpurea. Digitonin ha un'affinità per colesterolo ricchi membrane, dove si porta a membrana selettiva permeabiliztion ^14,16 (figura 1). Oltre a consentire l'uscita dei piccoli componenti citosolici, permeabilizzazione digitonina permette anche l'ingresso di molecole esogene quali proteinasi K o tripsina. Il protocollo FPP sfrutta il fact che la membrana plasmatica contiene fino al 80% del colesterolo cellulari ^17, mentre altri organelli, come ER, Golgi, endosomi, i mitocondri, che hanno molto basso contenuto di colesterolo, rimangono intatti ^14. L'incorporazione selettiva di colesterolo nella membrana plasmatica è stata osservata in molte cellule eucariotiche, permettendo l'uso di digitonina-dipendente permeabilizzazione della membrana plasmatica in tali diverse specie eucariotica come S. cerevisiae di umana ^14,18. Il dosaggio FPP fornisce un mezzo semplice, rapido e abbastanza robusti di determinazione (a) se una proteina è legato alla membrana / o associati liberamente diffusibile nel citosol e (b) che dominio di una proteina di membrana affronta citosol o organelli lumen. Qualora una proteina di membrana avere più orientamenti, il segnale sorgerà dalla forma dominante e non verrà rilevato forme minori. Mentre ci può essere qualche preoccupazione che l'aggiunta di una frazione GFP alla proteina di interesse può influire sulla sua funzione e/ O localizzazione subcellulare, questo è in realtà più teorica che reale. Infatti molti studi hanno chiaramente dimostrato che il tag GFP non altera le proprietà della proteina ^19,20.

Protocol

1. Generazione e convalida delle Chimere proteina fluorescente Append proteina fluorescente verde (GFP) alla ammino o carbossile termini della proteina di interesse utilizzando strategie di DNA ricombinante standard di 13. NOTA: Anche se abbiamo utilizzato ampiamente GFP, altre varianti come la proteina ciano fluorescente (PCP), proteina fluorescente gialla (YFP), DsRed e mCherry possono essere impiegati. Miglioramenti in fluoroforo pieghevole efficienza, luminosità e fotostabilità vengono…

Representative Results

Plasma permeabilizzazione della membrana Efficient permeabilizzazione della membrana plasmatica è determinato mediante l'uso di proteine ​​fluorescenti solubili (ad esempio, GFP, DsRed) (Passaggio 4). Queste proteine, quando espresso in cellule, sono liberi di diffondere nel citosol, e vengono persi quando la membrana plasmatica è permeabilizzate con digitonina (Figura 2). Una completa scomparsa del segnale fluorescente dovrebbe avvenire entro 10-…

Discussion

L'orientamento e la topologia corretta delle proteine ​​di membrana è essenziale per il loro corretto funzionamento. Nonostante l'importanza di comprendere la topologia proteina di membrana, ci sono molte proteine ​​per i quali i dati sono del tutto carenti. FPP fornisce un modo semplice ed efficace per determinare topologia proteina di membrana, e uno che può essere eseguita dalla maggior parte dei laboratori. L'approccio FPP offre vantaggi significativi rispetto ai metodi precedenti per la determ…

Materials

Name	Company	Catalgue Number	Comments
Digitonin	Calbiochem	300410
Proteinase K	Sigma	P2308
Trypsin	Sigma	T3924
Cav1-GFP	Addgene	44433
pAcGFP-1 Golgi	Clontech	632464
Polylysine	Sigma	P4707
Mounting Media	Dako	cS704