Het bepalen van membraaneiwit Topologie behulp Fluorescentie protease Protection (FPP)

Summary

Here, we present a protocol to determine the orientation and topology of integral membrane proteins in living cells. This simple protocol relies on selective protease sensitivity of chimeras between the protein of interest and GFP.

Abstract

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established for many membrane proteins. A simple technique called fluorescence protease protection (FPP) is presented, which permits the determination of membrane protein topology in living cells. This technique has numerous advantages over other methods for determining protein topology, in that it does not require the availability of multiple antibodies against various domains of the membrane protein, does not require large amounts of protein, and can be performed on living cells. The FPP method employs the spatially confined actions of proteases on the degradation of green fluorescent protein (GFP) tagged membrane proteins to determine their membrane topology and orientation. This simple approach is applicable to a wide variety of cell types, and can be used to determine membrane protein orientation in various subcellular organelles such as the mitochondria, Golgi, endoplasmic reticulum and components of the endosomal/recycling system. Membrane proteins, tagged on either the N-termini or C-termini with a GFP fusion, are expressed in a cell of interest, which is subject to selective permeabilization using the detergent digitonin. Digitonin has the ability to permeabilize the plasma membrane, while leaving intracellular organelles intact. GFP moieties exposed to the cytosol can be selectively degraded through the application of protease, whereas GFP moieties present in the lumen of organelles are protected from the protease and remain intact. The FPP assay is straightforward, and results can be obtained rapidly.

Introduction

De plasmamembranen, evenals talrijke intracellulaire membranen dienen als barrières tussen twee waterige compartimenten. Bij de plasmamembraan is de scheiding tussen de buitenkant en de binnenkant van de cel; voor intracellulaire organellen is tussen het cytoplasma en de organel lumen. Bijvoorbeeld, het endoplasmatisch reticulum (ER) membraan scheidt een oxiderende omgeving binnen het lumen van het ER een cytosolische reducerende omgeving ^1. Membraan eiwitten worden gesynthetiseerd op-ER geassocieerd ribosomen, en het bereiken van hun uiteindelijke topologie binnen de ER membraan ^2. De overname van de juiste membraan oriëntatie en topologie voor eiwitten is essentieel voor hun normale functie. Correct topologie maakt relevante domeinen van membraaneiwitten te communiceren met hun bindingspartners, het mogelijk kritische post-translationele modificaties optreden, en in het geval van plasma membraaneiwitten, kan de cel te interageren met en te reageren to zijn omgeving. Om de functie van een membraaneiwit volledig waarderen, is het duidelijk noodzakelijk om te weten hoe dit eiwit is georiënteerd ten opzichte van het membraan waarin deze zich bevindt, dat wil zeggen, de membraan topologie. Naast het verwerven van wetenschappelijke basiskennis begrijpen van de topologie van een membraaneiwit en die aspecten van een eiwit oppervlak blootgesteld aan verschillende milieu zijn klinische implicaties gemarkeerd aangezien membraaneiwitten omvatten de meeste farmacologische doelen ^3. Tot voor kort, benaderingen te bepalen membraaneiwit topologie aanzienlijke investering in tijd en geld hebben geëist of reagentia die moeilijk te verkrijgen zijn vereist.

Zowel experimentele als in silico benaderingen zijn gebruikt om de membraan topologie van eiwitten die binnen het plasmamembraan bepaalt. Aangezien de eerste voorspellingen van membraanomspannende domeinen basis van de geëvalueerde hydrofobiciteit van inddual aminozuren ^3, talrijke algoritmes zijn nu beschikbaar op het internet, en eenvoudig vereisen kennis van het eiwit aminozuursequentie. Echter, aannames zijn vaak de kern van deze modellering programma's, aannames die kunnen leiden tot onjuiste opgaven van de topologie ^4,5. Voorts terwijl deze computergebaseerde voorspellingen voorlopig membraanoverspannende gebieden kunnen toewijzen, zij niet altijd bepalen of de amino- of carboxy-termini van eiwitten in het cytoplasma, organel lumen of cel exterieur. Zelfs met meer rekenkracht en het gebruik van automatische leeralgoritmen ^6, zoals gegevens nog een model, en worden gevalideerd middels experimenteel verkregen gegevens. Directe experimentele bepaling van membraantopologie is uitgevoerd met panelen van monoklonale antilichamen met bekende epitopen verdeeld over het eiwit, waarbij de beoordeling van hun immunoreactiviteit werd vóór en na cel permeabilisatie. Ditbenadering vereist een reeks antilichamen die niet beschikbaar zijn voor het eiwit van interesse.

Een andere mogelijkheid is epitooplabels zoals myc of hemagglutinine (HA) in verschillende plaatsen in het eiwit, wederom gevolgd door bepaling van immunoreactiviteit voor en na membraan permeabilisatie ingenieur. Naast immunogene labels, enzymatische labels (zoals alkalisch fosfatase, β-galactosidase, of β-lactamase) en chemische modificaties zoals cysteine ​​scanning zijn allemaal gebruikt om membraaneiwit topologie ^7,8 bepalen. Een extra methode toegepast voor topologische kaart brengen van plasmamembraaneiwitten berust op een iets andere benadering van epitoop-merkers. In deze werkwijze de tag sequentie de N-gekoppelde glycosylering consensussequentie NXS / T. Omdat glycosylering optreedt wanneer een dergelijke sequentie aanwezig in het lumen van de biosynthetische route, de aanwezigheid van het label in een luminale versus iseen cytosolisch compartiment wordt gemakkelijk waargenomen als een massaverschuiving op SDS-PAGE gels. Een dergelijke aanpak is toegepast op de multispanning ionkanaal CFTR ^9. Hoewel al deze benaderingen zijn gebruikt, is het duidelijk dat ze allemaal aanzienlijke investeringen in de moleculaire biologie te genereren en de sequentie verdeelstuk constructen vereisen.

Om topologische informatie over transmembraaneiwitten zich binnen intracellulaire organellen te bepalen heeft bewezen een grotere uitdaging te zijn. De toepassing van fluorescentie gebaseerde technologie heeft echter de bepaling van membraantopologie veel eenvoudiger. De techniek van bimoleculaire fluorescentie complementatie (BiFC) berust op de wisselwerking tussen twee niet-fluorescerend fragmenten van een fluorescerend eiwit, herstel van de fluorescente eigenschappen van dat eiwit ^10. Hoewel aanvankelijk beschreven voor de bepaling van eiwit-eiwit interacties in vivo ^10, heeft deze benadering ook gebruiktaan membraaneiwit topologie in plantencellen ¹¹ bepalen. Deze benadering is echter ook tijdsintensief omdat het onderzoek generatie niet alleen fusie-eiwitten met het eiwit van belang maar ook diverse fusieproteïnen gericht naar het cytosol of organel lumen en vereist kennis die intracellulaire membranen het eiwit van interesse bevindt in .

Een alternatieve eenvoudiger benadering bepalen membraaneiwit topologie is beschreven ^12. De test Fluorescentie Protease bescherming (FPP) vereist het genereren van een fusie-eiwit tussen GFP en het gen van belang. De benadering is gebaseerd op de relatieve toegankelijkheid van niet-specifieke proteasen de GFP rest; naargelang GFP wordt beschermd tegen proteolyse door die in het lumen van intracellulaire organellen of wordt blootgesteld aan proteolyse door aanwezig in het cytosol. Dus als de GFP groep op het eiwit van interesse staat voor het cytoplasma, het wordt blootgesteld aanproteaseactiviteit en het fluorescentiesignaal verloren. Omgekeerd, indien het GFP groep op het eiwit van interesse staat voor een omgeving 'beschermd' van de protease (zoals de Golgi lumen) dan zal het fluorescentiesignaal blijven.

Om ervoor te zorgen proteasen om de cel in te voeren, maar intracellulaire membraan compartimenten het cholesterol bindend drug digitonine wordt gebruikt, niet in te voeren. Cholesterol is de dominante sterol in vertebraten, en specifiek in het plasmamembraan opzichte van intracellulaire compartimenten verrijkt. De glycoside toxine, digitonine, geëxtraheerd uit de plant Digitalis purpurea. Digitonine een affiniteit voor cholesterol rijke membranen, waar het leidt tot selectieve membraan permeabiliztion ^14,16 (Figuur 1). Naast het feit uitgang van kleine cytosolische componenten, digitonine permeabilisatie maakt ook de toegang van exogene moleculen, zoals proteinase K of trypsine. De FPP-protocol maakt gebruik van de fact de plasmamembraan bevat tot 80% van cellulaire cholesterol ^17, terwijl andere organellen, zoals ER, Golgi, endosomen, mitochondria, die zeer laag cholesterolgehalte hebben, intact ¹⁴ blijft. De selectieve opname van cholesterol in de plasmamembraan waargenomen in vele eukaryotische cellen, die het gebruik van digitonine-afhankelijke plasma membraan permeabilisatie in uiteenlopende eukaryotische soorten S. cerevisiae menselijke ^14,18. Het FPP assay een eenvoudige, snelle en vrij robuust middel van het bepalen (a) of een eiwit membraangebonden / associated of vrij diffundeerbaar in het cytosol en (b) die domein van een membraaneiwit kijkt het cytosol of organel lumen. Moet een membraaneiwit hebben meerdere oriëntaties, zal het signaal ontstaan ​​uit de dominante vorm en kleine vormen zal niet worden gedetecteerd. Hoewel er enige bezorgdheid dat de toevoeging van een GFP groep aan het eiwit van interesse functionaliteit kan beïnvloeden kan worden en/ Of subcellulaire lokalisatie, dit is eigenlijk meer theoretisch dan de werkelijke. Inderdaad veel studies hebben duidelijk aangetoond dat het GFP-tag niet de eigenschappen van het eiwit ^19,20 veranderen.

Protocol

1. Generatie en Validatie van Fluorescent Protein Chimeras Voeg groen fluorescerend eiwit (GFP) aan de amino of carboxyl termini van het eiwit van belang onder toepassing van standaard recombinant DNA strategieën 13. Opmerking Hoewel we intensief gebruikt GFP andere varianten zoals cyaan fluorescerend eiwit (CFP), geel fluorescerend eiwit (YFP), DsRed en mCherry kunnen worden toegepast. Verbeteringen in fluorofoor vouwen efficiëntie, helderheid en fotostabiliteit worden voortdurend gemaakt…

Representative Results

Plasmamembraan Permeabilisatie Efficiënte plasmamembraan permeabilisatie wordt bepaald door het gebruik van oplosbare fluorescerende eiwitten (bijvoorbeeld GFP, DsRed) (stap 4). Deze eiwitten, bij expressie in cellen vrij te diffunderen in het cytosol, en gaan verloren wanneer de plasma membraan doorlaatbaar gemaakt met digitonine (figuur 2). Een volledig verdwijnen van fluorescent signaal dient binnen 10-60 sec van digitonine toepassing. Bevestiging dat h…

Discussion

De juiste oriëntatie en topologie van membraaneiwitten essentieel is voor hun functie. Ondanks het belang van het begrijpen membraaneiwit topologie, zijn er vele eiwitten waarvoor dergelijke gegevens volledig ontbreekt. FPP biedt een eenvoudige en efficiënte manier om te bepalen membraaneiwit topologie, en een die kan worden uitgevoerd door de meeste laboratoria. De FPP aanpak biedt aanzienlijke voordelen ten opzichte van eerdere methoden om eiwitten topologie. Zo hoeft een panel van meervoudige antilichamen weer vers…

Materials

Name	Company	Catalgue Number	Comments
Digitonin	Calbiochem	300410
Proteinase K	Sigma	P2308
Trypsin	Sigma	T3924
Cav1-GFP	Addgene	44433
pAcGFP-1 Golgi	Clontech	632464
Polylysine	Sigma	P4707
Mounting Media	Dako	cS704