تحديد غشاء طوبولوجيا البروتين عن طريق الإسفار البروتياز الحماية (FPP)

Summary

Here, we present a protocol to determine the orientation and topology of integral membrane proteins in living cells. This simple protocol relies on selective protease sensitivity of chimeras between the protein of interest and GFP.

Abstract

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established for many membrane proteins. A simple technique called fluorescence protease protection (FPP) is presented, which permits the determination of membrane protein topology in living cells. This technique has numerous advantages over other methods for determining protein topology, in that it does not require the availability of multiple antibodies against various domains of the membrane protein, does not require large amounts of protein, and can be performed on living cells. The FPP method employs the spatially confined actions of proteases on the degradation of green fluorescent protein (GFP) tagged membrane proteins to determine their membrane topology and orientation. This simple approach is applicable to a wide variety of cell types, and can be used to determine membrane protein orientation in various subcellular organelles such as the mitochondria, Golgi, endoplasmic reticulum and components of the endosomal/recycling system. Membrane proteins, tagged on either the N-termini or C-termini with a GFP fusion, are expressed in a cell of interest, which is subject to selective permeabilization using the detergent digitonin. Digitonin has the ability to permeabilize the plasma membrane, while leaving intracellular organelles intact. GFP moieties exposed to the cytosol can be selectively degraded through the application of protease, whereas GFP moieties present in the lumen of organelles are protected from the protease and remain intact. The FPP assay is straightforward, and results can be obtained rapidly.

Introduction

أغشية البلازما، فضلا عن العديد من الأغشية داخل الخلايا، بمثابة الحواجز التي تفصل اثنين من مقصورات المائية. في حالة غشاء البلازما، والفصل هو بين الخارج والداخل من الخلية؛ لعضيات داخل الخلايا ومن بين السيتوبلازم والتجويف عضية. على سبيل المثال، غشاء الشبكة الإندوبلازمية (ER) يفصل بيئة المؤكسدة داخل تجويف ER من عصاري خلوي خفض البيئة ^1. ويتم تخليق البروتينات الغشاء على ريبوسوم المرتبط ER، وتحقيق طوبولوجيا النهائي داخل غشاء ER ^2. الاستيلاء على التوجه غشاء المناسب وطوبولوجيا للبروتينات هو أمر حاسم لوظيفتها الطبيعية. طوبولوجيا الصحيح يسمح المجالات ذات الصلة للبروتينات غشاء للتفاعل مع الشركاء ملزمة لها، لأنها تتيح التعديلات بعد متعدية حاسمة لتحدث، وذلك في حالة من البروتينات غشاء البلازما، بما يسمح للخلية للتفاعل مع ويستجيب رس بيئته. لنقدر تماما وظيفة بروتين الغشاء، لا بد من الواضح أن تعرف كيف يتم توجيه هذا البروتين فيما يتعلق غشاء من خلاله أنه يقيم، أي طوبولوجيا غشاء لها. بالإضافة إلى اكتساب المعرفة العلمية الأساسية، فهم طوبولوجيا من بروتين الغشاء والتي يتعرض لها جوانب سطح البروتين لبيئات مختلفة ميزت الآثار السريرية منذ تتكون البروتينات الغشاء غالبية أهداف الدوائية ^3. حتى وقت قريب، يقترب إلى تحديد بروتين الغشاء طوبولوجيا كان يتطلب استثمارات كبيرة في الوقت والمال أو كان يتطلب الكواشف التي يصعب الحصول عليها.

على حد سواء قد استخدمت النهج التجريبية وفي سيليكون لتحديد طوبولوجيا غشاء البروتينات المقيمين داخل غشاء البلازما. منذ التنبؤات الأولى من المجالات الغشاء الذي يمتد على أساس للا مائية تقييمها من indiviالأحماض الأمينية المزدوجة ^3، والعديد من خوارزميات التنبؤ متوفرة الآن على شبكة الإنترنت، وببساطة تتطلب معرفة تسلسل الأحماض الأمينية والبروتين. ومع ذلك، غالبا ما تكون الافتراضات المركزية لمثل هذه البرامج النمذجة، والافتراضات التي يمكن أن تؤدي إلى مهام غير صحيحة طوبولوجيا ^4،5. وعلاوة على ذلك، في حين يمكن لهذه التنبؤات القائمة على الحاسوب بتعيين مبدئيا المناطق التي تغطي الغشاء، أنها لا تحدد دائما ما إذا كان الأمينية أو مصطلحات كربوكسي البروتينات هي في السيتوبلازم، التجويف عضية أو الخارجي الخلية. حتى مع زيادة القوة الحسابية، واستخدام آلة التعلم خوارزميات ^6، مثل هذه البيانات لا تزال نموذجا، ويجب التحقق من صحة باستخدام البيانات التي حصل عليها تجريبيا. تم إجراء تقرير التجريبي المباشر للطوبولوجيا الغشاء باستخدام لوحات من الأجسام المضادة وحيدة النسيلة مع الحواتم المعروف توزع في جميع أنحاء البروتين، حيث أحرز تقييم مناعية، قبل وبعد permeabilization الخلية. هذاالنهج يتطلب مجموعة من الأجسام المضادة، التي قد لا تكون متاحة للبروتين من الفائدة.

استراتيجية بديلة هو مهندس علامات حاتمة مثل MYC أو هيماغلوتينين (HA) في مواقع مختلفة في جميع أنحاء البروتين، ثم مرة أخرى عن طريق تحديد مناعية قبل وبعد permeabilization الغشاء. بالإضافة إلى علامات المناعية، كلها قد استخدمت علامات الأنزيمية (بما في ذلك الفوسفاتيز القلوية، β -galactosidase، أو β -lactamase) والتعديلات الكيميائية مثل مسح السيستين لتحديد بروتين الغشاء طوبولوجيا ^7،8. طريقة إضافية تستخدم لرسم الخرائط الطوبوغرافية للبروتينات غشاء البلازما يعتمد على مقاربة مختلفة قليلا إلى علامات حاتمة. في هذه الطريقة تسلسل العلامة هو N-ربط تسلسل إجماع بالغليكوزيل NXS / T. منذ بالغليكوزيل يحدث فقط عندما مثل هذا التسلسل هو موجود في تجويف مسار السكروز، فإن وجود علامة في اللمعية مقابلويلاحظ حجرة عصاري خلوي بسهولة كما تحول الشامل على المواد الهلامية SDS-PAGE. وقد تم تطبيق هذا النهج إلى multispanning القناة الايونية CFTR ^9. في حين استخدمت كل هذه الأساليب، فمن الواضح أنهم جميعا تتطلب استثمارات كبيرة في مجال البيولوجيا الجزيئية لتوليد وتسلسل بنيات متعددة.

لتحديد المعلومات الطوبوغرافية المتعلقة البروتينات عبر الغشاء الموجود داخل عضيات داخل الخلايا وقد ثبت أن أكثر تحديا. تطبيق التكنولوجيات القائمة مضان ومع ذلك، جعلت تحديد الغشاء طوبولوجيا أبسط كثيرا. تقنية ثنائي الجزيء تكامل مضان (BiFC) تعتمد على التفاعل بين اثنين من شظايا غير الفلورية من بروتين فلوري، واستعادة خصائص الفلورسنت من أن البروتين ^10. على الرغم من وصف في البداية لتحديد تفاعلات البروتين البروتين في الجسم الحي ^10، كما تم استخدام هذا النهجلتحديد بروتين الغشاء طوبولوجيا في الخلايا النباتية ^11. ولكن هذا النهج هو أيضا الوقت المكثف لأنه يتطلب الجيل ليس فقط من البروتينات الانصهار مع بروتين من الفائدة ولكن أيضا مجموعة متنوعة من البروتينات الانصهار تستهدف العصارة الخلوية أو عضية التجويف، ويتطلب المعرفة التي بين الخلايا الأغشية البروتين من الفائدة تكمن في .

وقد وصفت نهج بديل أبسط لتحديد بروتين الغشاء طوبولوجيا ^12. الفحص، الإسفار البروتياز الحماية (FPP) يتطلب توليد البروتين الانصهار بين GFP والجينات في المصالح. ويستند هذا النهج على إمكانية الوصول النسبي للالبروتياز غير محددة لشاردة GFP. اعتمادا على ما إذا GFP محمي من التحلل البروتيني من قبل المقيمين في لمعة من العضيات داخل الخلايا أو يتعرض لالتحلل البروتيني من خلال كونها موجودة في العصارة الخلوية. وهكذا، إذا شاردة GFP على البروتين من الفائدة تواجه السيتوبلازم، فانها ستكون معرضة لنشاط الأنزيم البروتيني وإشارة مضان خسر. على العكس، إذا شاردة GFP على البروتين من الفائدة تواجه بيئة 'محمية' من البروتيني (مثل التجويف جولجي) ثم فإن إشارة مضان تستمر.

للسماح البروتياز لدخول الخلية، ولكن لا تدخل مقصورات غشاء الخلايا ويستخدم الكوليسترول ملزمة ديجيتونين المخدرات. الكولسترول هو ستيرول المهيمن في الفقاريات، وإثراء تحديدا في غشاء البلازما نسبة إلى المقصورات داخل الخلايا. السم غليكوزيدات، ديجيتونين، يستخرج من نبات الديجيتال الأرجواني. ديجيتونين يتعاطف مع الكولسترول أغشية الغنية، حيث أنه يؤدي إلى غشاء انتقائي permeabiliztion ^14،16 (الشكل 1). بالإضافة إلى السماح بخروج عناصر عصاري خلوي صغيرة، يسمح permeabilization ديجيتونين أيضا دخول جزيئات الخارجية، مثل K بروتين أو التربسين. بروتوكول FPP يستفيد من القوات المسلحة الكونغوليةر التي تحتوي على غشاء البلازما تصل إلى 80٪ من الكولسترول الخلوي ^17، في حين العضيات الأخرى، مثل ER، جولجي، الإندوسومات، الميتوكوندريا، والتي تحتوي على محتوى الكولسترول منخفض جدا، لا تزال سليمة ^14. وقد لوحظ إدراج الانتقائي للالكولسترول في غشاء البلازما في العديد من الخلايا حقيقية النواة، السماح باستخدام تعتمد على ديجيتونين permeabilization غشاء البلازما في مثل هذه الأنواع حقيقية النواة متنوعة مثل S. الخباز لالبشري ^14،18. يوفر الفحص FPP وسيلة بسيطة وسريعة وقوية نسبيا من تحديد (أ) ما إذا كان البروتين هو غشاء ملزمة / اسوشيتد أو إنتشاري بحرية في العصارة الخلوية و (ب) والذي المجال من البروتين غشاء يواجه العصارة الخلوية أو عضية التجويف. يجب أن بروتين الغشاء لديها توجهات متعددة، فإن إشارة تنشأ من النموذج المهيمن، ولن يتم الكشف عن أشكال طفيفة. في حين يمكن أن يكون هناك بعض القلق من أن إضافة شاردة GFP للبروتين على الفائدة قد تؤثر على وظيفة، و/ أو توطين التحت خلوية، وهذا هو في الواقع أكثر من النظري الفعلية. في الواقع العديد من الدراسات قد أظهرت بوضوح أن العلامة GFP لا يغير خصائص البروتين ^19،20.

Protocol

1. الجيل والتحقق من الوهم بروتين فلوري إلحاق البروتين الفلوري الأخضر (GFP) إلى الأمينية أو الكربوكسيل مصطلحات من البروتين ذات الاهتمام باستخدام استراتيجيات الحمض النووي المؤتلف القياسية 13. ملاحظة: على الرغم م…

Representative Results

البلازما غشاء Permeabilization يتم تحديد كفاءة permeabilization غشاء البلازما عن طريق استخدام البروتينات الفلورية القابلة للذوبان (على سبيل المثال، GFP، DsRed) (الخطوة 4). هذه البروتينات، عندما أعرب في الخلايا، أحرار في نشر في العصارة الخل…

Discussion

التوجه الصحيح وطوبولوجيا من بروتينات الغشاء أمر ضروري لوظيفتها المناسبة. وعلى الرغم من أهمية فهم بروتين الغشاء طوبولوجيا، هناك العديد من البروتينات التي مثل هذه البيانات غير موجودة تماما. يوفر FPP طريقة سهلة وفعالة لتحديد بروتين الغشاء طوبولوجيا، واحد التي يمكن الق?…

Materials

Name	Company	Catalgue Number	Comments
Digitonin	Calbiochem	300410
Proteinase K	Sigma	P2308
Trypsin	Sigma	T3924
Cav1-GFP	Addgene	44433
pAcGFP-1 Golgi	Clontech	632464
Polylysine	Sigma	P4707
Mounting Media	Dako	cS704