Summary

Propagación de<em> Homalodisca coagulata virus-01</em> A través de<em> Homalodisca vitripennis</em> Cultivo Celular

Published: September 25, 2014
doi:

Summary

Aquí se presenta un protocolo para propagar células Homalodisca vitripennis y HoCV-1 in vitro. Se retiró el medio de HoCV-1 cultivos positivos y ARN extraído cada 24 h durante 168 horas. Supervivencia celular se cuantificó mediante tinción con azul de tripano. Partículas virales enteras fueron extraídos después de la infección. ARN extraído se cuantificó por QRT-PCR.

Abstract

La chicharrita de alas cristalinas (Homalodisca vitripennis) es un insecto altamente vagile y polífagas encuentra en todo el suroeste de los Estados Unidos. Estos insectos son los vectores predominantes de Xylella fastidiosa (X. fastidiosa), una bacteria xilema limitado que es el agente causal de la enfermedad de Pierce (PD) de la vid. La enfermedad de Pierce es económicamente perjudicial; Por lo tanto, H. vitripennis se han convertido en un objetivo para las estrategias de manejo de patógenos. Un dicistrovirus identificado como Homalodisca coagulata virus-01 (HoCV-01) se ha asociado con un aumento de la mortalidad en H. poblaciones vitripennis. Debido a que se requiere una célula huésped para la replicación HoCV-01, cultivo celular proporciona un entorno uniforme para la replicación dirigida que es logísticamente y económicamente valiosa para la producción de biopesticida. En este estudio, un sistema para la propagación a gran escala de H. vitripennis células a través de cultivo de tejidos se desarrolló, providing un mecanismo de replicación viral. HoCV-01 se extrajo de insectos de todo el cuerpo y se usa para inocular H. cultivaron vitripennis células en diferentes niveles. El medio de cultivo se eliminó cada 24 h durante 168 h, ARN extraído y analizado con QRT-PCR. Las células se tiñeron con azul de tripano y se contaron para cuantificar la supervivencia celular usando microscopía de luz. Partículas de virus enteros se extrajeron hasta 96 h después de la infección, que fue el punto de tiempo determinado que antes de producirse el colapso total de cultivo celular. Las células también se sometieron a tinción fluorescente y vistos usando microscopía confocal para investigar la actividad viral en la F-actina apego y núcleos integridad. La conclusión de este estudio es que el H. vitripennis células son capaces de ser cultivadas y se utiliza para la producción en masa de HoCV-01 a un nivel adecuado para permitir la producción de un bioplaguicida.

Introduction

La chicharrita de alas cristalinas (Homalodisca vitripennis Germar 1821) ha sido identificado como el vector predominante de Xylella fastidiosa (X. fastidiosa), el agente causal de la enfermedad de la vid (PD) de Pierce en América del Norte 1. Gestión de la población de insectos se ha convertido rápidamente en el foco de la investigación para combatir esta devastadora problema para la industria de la viticultura en California y en todo el sur de Estados Unidos. Una de sentido positivo, el virus de ARN monocatenario perteneciente a la familia Dicistroviridae, Homalodisca coagulata virus-01 (HoCV-01) ha sido identificada en H. salvaje poblaciones vitripennis y demostrado que aumenta la mortalidad en las poblaciones 2-4, al tiempo que reduce la resistencia de los insectos a los insecticidas.

Desarrollo de métodos para efectivamente trasera infectada H. vitripennis hasta la edad adulta en un entorno de laboratorio han sido difíciles porque <em> H. vitripennis tienen diferentes necesidades nutricionales de una etapa específica que requieren una variedad de plantas huésped 5.8. Instalaciones específicas están obligados a H. vivo trasera vitripennis en los Estados Unidos; Por lo tanto, el cultivo de células es más económico y una alternativa viable, así como cada vez más vital para HoCV-01 de detección y la replicación 2,9. Mientras que los métodos básicos para el establecimiento de cultivos de células de H. vitripennis se describen, estos métodos aún no se han utilizado para la producción comercial de agentes de control biológico, tales como virus 2.

El objetivo general de los siguientes procedimientos es producir una alta concentración de HoCV-01 adecuado para la utilización como agente de control biológico. La replicación viral requiere de una célula viva, que es la razón por cultivar con éxito y optimizar H. vitripennis culturas es vital para el progreso de la producción de los niveles rentables de virus.

Protocol

1. Cell Culture NOTA: Las líneas celulares Homalodisca vitripennis establecidos por el laboratorio del Dr. Wayne Hunter en el Servicio de Investigación Agrícola del USDA (Ft. Pierce, FL EE.UU.) se utilizan para iniciar una acción de laboratorio compuesto por etapas de células mixtas incluyendo fibroblastos y monocapas iniciales. Lleve a cabo los siguientes procedimientos en un entorno de laboratorio estéril mantenido a una temperatura de 20-24 ° C con 25 frascos de…

Representative Results

La unión celular y el crecimiento se observó dentro de las 48 horas de paso en los dos frascos de cultivo de pequeños y grandes, a partir de cultivos primarios y pasajes continuos. Crecimiento y desarrollo de fibroblastos también se observó dentro de este marco de tiempo. Cuando frascos recién sembrados fueron perturbados antes de 48 horas, se produjo una disminución visible en la unión de las células, lo que lleva a las culturas de crecimiento más lento ya veces no sujeción o de crecimiento en absoluto. Las …

Discussion

El aumento de las preocupaciones en cuanto a la afluencia de especies agrícolas invasivas han llevado a una mayor demanda de nuevas metodologías para la defensa frente a plagas y patógenos emergentes. Un enfoque de la prevención y manejo de la enfermedad consiste en la gestión de vectores de patógenos y era el objetivo principal de este estudio. Economía desempeñan un papel vital en la decisión de producir este tipo de bioplaguicida para manejar vectores de patógenos en la agricultura debido a la aplicación p…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We would like to thank the Texas Pierce’s Disease Research and Education Program and USDA-APHIS for their funding support for this project. We would also like to thank Hema Kothari at the University of Texas Health Science Center at Tyler for her assistance with confocal microscopy.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Corning cell culture flasks Sigma Aldrich CLS430168 Surface area 25 cm2, canted neck, cap (plug seal)
Olympus DP30BW, IX2-SP, IX71 Olympus Inverted microscope and camera
Trypsin-EDTA solution Sigma Aldrich T4049 0.25%, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture, 2.5 g porcine trypsin and 0.2 g EDTA • 4Na per liter of Hanks′ Balanced Salt Solution with phenol red
Greiner CELLSTAR multiwell culture plates Sigma Aldrich M8937 48 wells (TC treated with lid)
DETCA  Sigma Aldrich 228680 Sodium diethyldithiocarbamate trihydrate
Corning bottle-top vacuum filter system Sigma Aldrich CLS431206 Cellulose acetate membrane, pore size 0.45 μm, membrane area 54.5 cm2, filter capacity 500 mL
Brij 52 Sigma Aldrich 388831 Polyethylene glycol hexadecyl ether
Phosphate buffer solution Sigma Aldrich P5244 Recieved as 100mM diluted to 10mM with sterile water
TRIzol LS  Life Technologies 10296-028
Agarose Sigma Aldrich A5304 For electrophoresis
Ethidium bromide Sigma Aldrich E7637 BioReagent, for molecular biology, powder
QIAquick Qiagen 28704
QuantiTect qRT-PCR kit  Qiagen 204243
4% paraformaldehyde  Sigma Aldrich P6148  Reagent grade, crystalline
PBS  Sigma Aldrich P5368 Phosphate buffered saline
Triton X-100  Sigma Aldrich X100
Bovine serum albumin (BSA) Sigma Aldrich A2153
Rhodamine red-conjugated phalloidin  Life Technologies R415 Rhodamine phalloidin is a high-affinity F-actin probe conjugated to the red-orange fluorescent dye, tetramethylrhodamine
DAPI  Sigma Aldrich D9542
ProLong Gold Antifade Reagent Life Technologies P36934
LSM510 Meta Confocal System  Carl Zeiss
LSM Zen 2007 Software Carl Zeiss
Grace’s Insect medium (supplemented, 1X) Sigma Aldrich G8142 H2G+ leafhopper medium component
L-histidine monohydrate Sigma Aldrich H8125 H2G+ leafhopper medium component
Medium 199 (10X) Sigma Aldrich M4530 H2G+ leafhopper medium component
Medium 1066 (1X) Sigma Aldrich C0422 H2G+ leafhopper medium component
Hank’s Balanced Salts (1X) Sigma Aldrich 51322C H2G+ leafhopper medium component
L-Glutamine (100X) Sigma Aldrich G3126 H2G+ leafhopper medium component
MEM, amino acid mix (50X) Sigma Aldrich 56419C H2G+ leafhopper medium component
1 M MgCl solution Sigma Aldrich M8266 H2G+ leafhopper medium component
Pen-Strep (w/ Glutamine) Sigma Aldrich G6784 H2G+ leafhopper medium component
Nystatin Sigma Aldrich N6261 H2G+ leafhopper medium component
Gentamycin Sigma Aldrich 46305 H2G+ leafhopper medium component
Dextrose Sigma Aldrich D9434 H2G+ leafhopper medium component
Fetal Bovine Serum Sigma Aldrich F2442 H2G+ leafhopper medium component

References

  1. Takiya, D. M., McKamey, S. H., Cavichioli, R. R. Validity of Homalodisca and of H. vitripennis as the Name for Glassy-winged Sharpshooter (Hemiptera: Cicadellidae: Cicadellinae). Ann. Entomol. Soc. Am. 99 (4), 648-655 (2006).
  2. Hunter, W. B., Katsar, C. S., Chaparro, J. X. Molecular analysis of capsid protein of Homalodisca coagulata Virus-1, a new leafhopper-infecting virus from the glassy-winged sharpshooter, Homalodisca coagulata. J. Insect Sci. 6 (28), 1-10 (2006).
  3. Hunnicutt, L. E., Hunter, W. B., Cave, R. D., Powell, C. A., Mozoruk, J. J. Genome sequence and molecular characterization of Homalodisca coagulata virus-1, a novel virus discovered in the glassy-winged sharpshooter (Hemiptera: Cicadellidae). Virology. 350 (1), 67-78 (2006).
  4. Hunnicutt, L. E., Mozoruk, J., Hunter, W. B., Crosslin, J. M., Cave, R. D., Powell, C. D. Prevalence and natural host range of Homalodisca coagulata virus-1 (HoCV-1). Virology. 153, 61-67 (2008).
  5. Jones, W. A., Setamou, M. Biology and Biometry of Sharpshooter Homalodisca coagulata (Homoptera) Cicadellidae) Reared on Cowpea. Ann. Entomol. Soc. Am. 98 (3), 322-328 (2005).
  6. Turner, W. F., Pollard, H. N. Life histories and behavior of five insect vectors of phony peach disease. US Dep. Agric. Tech. Bull. 1188, 1-32 (1959).
  7. Brodbeck, B. V., Andersen, P. C., Mizell, R. F. Utilization of primary nutrients by the polyphagous xylophage, Homalodisca coagulata, reared on single host species. Arch. Insect Biochem. Physiol. 32, 65-83 (1996).
  8. Brodbeck, B. V., Andersen, P. C., Mizell, R. F. Effects of total dietary nitrogen and nitrogen form on the development of xylophagous leafhoppers. Arch. Insect Biochem. Physiol. 42, 37-50 (1999).
  9. Kamita, S. G., Do, Z. N., Samra, A. I., Halger, J. R., Hammock, B. D. Characterization of Cell Lines Developed from the Glassy-winged Sharpshooter, Homalodisca coagulata (Hemiptera: Cicadellidae). In vitro Cell Dev.-An. 41, 149-153 (2005).
  10. Hunter, W. B. Medium for development of bee cell cultures (Apis mellifera: Hymenoptera: Apidae). In vitro Cell Dev.-An. 46 (2), 83-86 (2010).
  11. Bextine, B., Hunter, W., Marshall, P., Hail, D. Identification and whole extraction of Homalodisca coagulata-virus01. (HoCV-01) from Texas glassy-winged sharpshooter populations. , 9-12 (2009).
  12. Rhoades, D. J. Economics of baculovirus – insect cell production. Cytotechnology. 20, 291-297 (1996).
  13. Briske-Anderson, M. J., Finley, J. W., Newman, S. M. The influence of culture time and passage number on the morphological and physiological development of Caco-2 cells. P. Soc. Exp. Biol. Med. 214 (3), 248-257 (1997).
  14. Chin, L., et al. Deficiency Rescues the Adverse Effects of Telomere Loss and Cooperates with Telomere Dysfunction to Accelerate Carcinogenesis. Cell. 97 (4), 527-538 (1999).
  15. Counter, C. M., et al. Telomere shortening associated with chromosome instability is arrested in immortal cells which express telomerase activity. Embo. J. 11, 1921-1929 (1992).
  16. Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Exp. Cell. Res. 25, 585-621 (1961).
  17. Goetz, I. E., Moklebust, R., Warren, C. J. Effects of some antibiotics on the growth of human diploid skin fibroblasts in cell culture. In Vitro. 15 (2), 114-119 (1979).
  18. Coriell, L. L., Fogh, J. .. Methods of prevention of bacterial, fungal, and other contaminations. Contamination in Tissue Culture. , 29-49 (1973).
  19. Hambor, J. E. Bioreactor Design and Bioprocess Controls for Industrialized Cell Processing. Bioprocess Tech. Bull. 10 (6), 22-33 (2012).
  20. Abbot, A., Cyranoski, D. Biology’s new dimension. Nature. 424, 870-872 (2003).

Play Video

Cite This Article
Biesbrock, A. M., Powell, C. M., Hunter, W. B., Bextine, B. R. Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture. J. Vis. Exp. (91), e51953, doi:10.3791/51953 (2014).

View Video