Summary

نشر<em> Homalodisca coagulata فيروس-01</em> عبر<em> Homalodisca vitripennis</em> الثقافة خلية

Published: September 25, 2014
doi:

Summary

هنا نقدم بروتوكول لنشر خلايا Homalodisca vitripennis وHoCV-1 في المختبر. تمت إزالة المتوسطة من HoCV-1 الثقافات الإيجابية والحمض النووي الريبي المستخرج كل 24 ساعة عن 168 ساعة. وكان كميا البقاء على قيد الحياة الخلية تلطيخ التريبان الأزرق. تم استخراج جزيئات الفيروس كاملة بعد الإصابة. وكان كميا الحمض النووي الريبي المستخرج من QRT-PCR.

Abstract

التصويب زجاجي الجناحين (Homalodisca vitripennis) هو حشرة vagile للغاية ومتعددة العائل جدت في جميع أنحاء جنوب غرب الولايات المتحدة. هذه الحشرات هي ناقلات الغالبة من Xylella fastidiosa (اكس fastidiosa)، وهي بكتيريا محدودة الخشب الذي هو العامل المسبب للمرض بيرس (PD) من الكرمة. مرض بيرس غير ضار اقتصاديا؛ وبالتالي، H. أصبحت vitripennis هدفا لاستراتيجيات إدارة الممرض. ارتبط وdicistrovirus يدعى Homalodisca coagulata فيروس-01 (HoCV-01) مع زيادة في الوفيات H. السكان vitripennis. لأنه مطلوب الخلية المضيفة لHoCV-01 التكرار، توفر زراعة الخلايا بيئة موحدة للنسخ المتماثل المستهدفة التي هي لوجستيا واقتصاديا قيمة لإنتاج المبيدات الحيوية. في هذه الدراسة، ونظام للنشر على نطاق واسع من H. وقد تم تطوير خلايا vitripennis عن طريق زراعة الأنسجة، صroviding آلية تكاثر الفيروس. تم استخراج HoCV-01 من الحشرات الجسم كله ويستخدم لتطعيم H. مثقف خلايا vitripennis على مستويات مختلفة. تمت إزالة مستنبت كل 24 ساعة ل168 ساعة، وتحليل الحمض النووي الريبي المستخرج مع QRT-PCR. تم صبغ الخلايا مع الأزرق التريبان وعدها لتحديد البقاء على قيد الحياة الخلية باستخدام المجهر الضوئي. تم استخراج جزيئات الفيروس كلها تصل إلى 96 ساعة بعد الإصابة، التي كانت نقطة زمنية مصممة على أن تكون قبل حدوث الانهيار التام ثقافة الخلية. تعرض الخلايا أيضا إلى تلطيخ الفلورسنت وعرضها باستخدام متحد البؤر المجهري للتحقيق في النشاط الفيروسي على F-أكتين التعلق ونوى النزاهة. الاستنتاج من هذه الدراسة هو أن H. vitripennis خلايا قادرة على المستزرعة وتستخدم لانتاج كميات كبيرة من HoCV-01 على مستوى مناسب للسماح إنتاج المبيدات الحيوية.

Introduction

تم التعرف التصويب زجاجي الجناحين (Homalodisca vitripennis في Germar 1821) باعتباره المسيطر من Xylella fastidiosa (اكس fastidiosa)، العامل المسبب للمرض بيرس من الكرمة (PD) في أمريكا الشمالية 1. إدارة السكان الحشرات سرعان ما أصبح محور البحوث لمكافحة هذه المشكلة المدمرة لصناعة زراعة الكروم في ولاية كاليفورنيا وعبر جنوب الولايات المتحدة. A-بالمعنى الإيجابي، واحد الذين تقطعت بهم السبل فيروس RNA عائلة Dicistroviridae، Homalodisca-01 فيروس تم التعرف coagulata (HoCV-01) في H. البرية السكان vitripennis وتبين أن زيادة معدل الوفيات في هؤلاء السكان 2-4، في حين خفض مقاومة الحشرات للمبيدات الحشرية.

تطوير أساليب فعالة إلى الخلف المصابة H. كانت vitripennis إلى مرحلة البلوغ في إعداد مختبر صعبا بسبب <eم> H. vitripennis لديها مختلف الاحتياجات الغذائية مراحل محددة تتطلب مجموعة متنوعة من النباتات المضيفة 5-8. ويلزم مرافق محددة لH. الحي الخلفي vitripennis في الولايات المتحدة؛ وبالتالي، ثقافة الخلية هي أكثر اقتصادا وبديلة قابلة للحياة، فضلا عن الحيوية على نحو متزايد لHoCV-01 كشف والتكرار 2،9. حين طرق أساسية لإنشاء مزارع الخلايا من H. يتم وصف vitripennis، ولم تستخدم هذه الأساليب للإنتاج التجاري من عوامل المكافحة البيولوجية، مثل الفيروسات 2.

الهدف العام المتمثل في الإجراءات التالية هو إنتاج نسبة عالية من HoCV-01 مناسبة للاستخدام كعامل المكافحة البيولوجية. يتطلب تكاثر الفيروس الخلية الحية، وهذا هو السبب زراعة بنجاح وتحسين H. الثقافات vitripennis أمر حيوي لتقدم مستويات إنتاج مربحة من الفيروس.

Protocol

الثقافة 1. خلية ملاحظة: تم استخدام خطوط الخلايا Homalodisca vitripennis أنشئت من قبل المختبر الدكتور واين هنتر في خدمة البحوث الزراعية وزارة الزراعة الأمريكية (فورت بيرس، فلوريدا الولايات المتحدة الأمريكية.) لبدء الأسهم المختبر يتألف م?…

Representative Results

كان ينظر مرفق الخلية والنمو خلال 48 ساعة من مرور في كل من قوارير ثقافة الصغيرة والكبيرة، من ثقافات الابتدائية والممرات استمرار. وقد لوحظ نمو الخلايا الليفية والتنمية أيضا ضمن هذا الإطار الزمني. عندما تم بالانزعاج قوارير المصنفة حديثا قبل 48 ساعة، كان هناك انخفاض واضح ?…

Discussion

وقد يؤدي تزايد المخاوف بشأن تدفق الأنواع الغازية الزراعية إلى زيادة الطلب على منهجيات جديدة للدفاع ضد الآفات ومسببات الأمراض الناشئة. وتركز الوقاية من الأمراض وإدارة ينطوي إدارة ناقلات الممرض وكان الهدف الرئيسي من هذه الدراسة. الاقتصاد تلعب دورا حيويا في قرار ل?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We would like to thank the Texas Pierce’s Disease Research and Education Program and USDA-APHIS for their funding support for this project. We would also like to thank Hema Kothari at the University of Texas Health Science Center at Tyler for her assistance with confocal microscopy.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Corning cell culture flasks Sigma Aldrich CLS430168 Surface area 25 cm2, canted neck, cap (plug seal)
Olympus DP30BW, IX2-SP, IX71 Olympus Inverted microscope and camera
Trypsin-EDTA solution Sigma Aldrich T4049 0.25%, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture, 2.5 g porcine trypsin and 0.2 g EDTA • 4Na per liter of Hanks′ Balanced Salt Solution with phenol red
Greiner CELLSTAR multiwell culture plates Sigma Aldrich M8937 48 wells (TC treated with lid)
DETCA  Sigma Aldrich 228680 Sodium diethyldithiocarbamate trihydrate
Corning bottle-top vacuum filter system Sigma Aldrich CLS431206 Cellulose acetate membrane, pore size 0.45 μm, membrane area 54.5 cm2, filter capacity 500 mL
Brij 52 Sigma Aldrich 388831 Polyethylene glycol hexadecyl ether
Phosphate buffer solution Sigma Aldrich P5244 Recieved as 100mM diluted to 10mM with sterile water
TRIzol LS  Life Technologies 10296-028
Agarose Sigma Aldrich A5304 For electrophoresis
Ethidium bromide Sigma Aldrich E7637 BioReagent, for molecular biology, powder
QIAquick Qiagen 28704
QuantiTect qRT-PCR kit  Qiagen 204243
4% paraformaldehyde  Sigma Aldrich P6148  Reagent grade, crystalline
PBS  Sigma Aldrich P5368 Phosphate buffered saline
Triton X-100  Sigma Aldrich X100
Bovine serum albumin (BSA) Sigma Aldrich A2153
Rhodamine red-conjugated phalloidin  Life Technologies R415 Rhodamine phalloidin is a high-affinity F-actin probe conjugated to the red-orange fluorescent dye, tetramethylrhodamine
DAPI  Sigma Aldrich D9542
ProLong Gold Antifade Reagent Life Technologies P36934
LSM510 Meta Confocal System  Carl Zeiss
LSM Zen 2007 Software Carl Zeiss
Grace’s Insect medium (supplemented, 1X) Sigma Aldrich G8142 H2G+ leafhopper medium component
L-histidine monohydrate Sigma Aldrich H8125 H2G+ leafhopper medium component
Medium 199 (10X) Sigma Aldrich M4530 H2G+ leafhopper medium component
Medium 1066 (1X) Sigma Aldrich C0422 H2G+ leafhopper medium component
Hank’s Balanced Salts (1X) Sigma Aldrich 51322C H2G+ leafhopper medium component
L-Glutamine (100X) Sigma Aldrich G3126 H2G+ leafhopper medium component
MEM, amino acid mix (50X) Sigma Aldrich 56419C H2G+ leafhopper medium component
1 M MgCl solution Sigma Aldrich M8266 H2G+ leafhopper medium component
Pen-Strep (w/ Glutamine) Sigma Aldrich G6784 H2G+ leafhopper medium component
Nystatin Sigma Aldrich N6261 H2G+ leafhopper medium component
Gentamycin Sigma Aldrich 46305 H2G+ leafhopper medium component
Dextrose Sigma Aldrich D9434 H2G+ leafhopper medium component
Fetal Bovine Serum Sigma Aldrich F2442 H2G+ leafhopper medium component

References

  1. Takiya, D. M., McKamey, S. H., Cavichioli, R. R. Validity of Homalodisca and of H. vitripennis as the Name for Glassy-winged Sharpshooter (Hemiptera: Cicadellidae: Cicadellinae). Ann. Entomol. Soc. Am. 99 (4), 648-655 (2006).
  2. Hunter, W. B., Katsar, C. S., Chaparro, J. X. Molecular analysis of capsid protein of Homalodisca coagulata Virus-1, a new leafhopper-infecting virus from the glassy-winged sharpshooter, Homalodisca coagulata. J. Insect Sci. 6 (28), 1-10 (2006).
  3. Hunnicutt, L. E., Hunter, W. B., Cave, R. D., Powell, C. A., Mozoruk, J. J. Genome sequence and molecular characterization of Homalodisca coagulata virus-1, a novel virus discovered in the glassy-winged sharpshooter (Hemiptera: Cicadellidae). Virology. 350 (1), 67-78 (2006).
  4. Hunnicutt, L. E., Mozoruk, J., Hunter, W. B., Crosslin, J. M., Cave, R. D., Powell, C. D. Prevalence and natural host range of Homalodisca coagulata virus-1 (HoCV-1). Virology. 153, 61-67 (2008).
  5. Jones, W. A., Setamou, M. Biology and Biometry of Sharpshooter Homalodisca coagulata (Homoptera) Cicadellidae) Reared on Cowpea. Ann. Entomol. Soc. Am. 98 (3), 322-328 (2005).
  6. Turner, W. F., Pollard, H. N. Life histories and behavior of five insect vectors of phony peach disease. US Dep. Agric. Tech. Bull. 1188, 1-32 (1959).
  7. Brodbeck, B. V., Andersen, P. C., Mizell, R. F. Utilization of primary nutrients by the polyphagous xylophage, Homalodisca coagulata, reared on single host species. Arch. Insect Biochem. Physiol. 32, 65-83 (1996).
  8. Brodbeck, B. V., Andersen, P. C., Mizell, R. F. Effects of total dietary nitrogen and nitrogen form on the development of xylophagous leafhoppers. Arch. Insect Biochem. Physiol. 42, 37-50 (1999).
  9. Kamita, S. G., Do, Z. N., Samra, A. I., Halger, J. R., Hammock, B. D. Characterization of Cell Lines Developed from the Glassy-winged Sharpshooter, Homalodisca coagulata (Hemiptera: Cicadellidae). In vitro Cell Dev.-An. 41, 149-153 (2005).
  10. Hunter, W. B. Medium for development of bee cell cultures (Apis mellifera: Hymenoptera: Apidae). In vitro Cell Dev.-An. 46 (2), 83-86 (2010).
  11. Bextine, B., Hunter, W., Marshall, P., Hail, D. Identification and whole extraction of Homalodisca coagulata-virus01. (HoCV-01) from Texas glassy-winged sharpshooter populations. , 9-12 (2009).
  12. Rhoades, D. J. Economics of baculovirus – insect cell production. Cytotechnology. 20, 291-297 (1996).
  13. Briske-Anderson, M. J., Finley, J. W., Newman, S. M. The influence of culture time and passage number on the morphological and physiological development of Caco-2 cells. P. Soc. Exp. Biol. Med. 214 (3), 248-257 (1997).
  14. Chin, L., et al. Deficiency Rescues the Adverse Effects of Telomere Loss and Cooperates with Telomere Dysfunction to Accelerate Carcinogenesis. Cell. 97 (4), 527-538 (1999).
  15. Counter, C. M., et al. Telomere shortening associated with chromosome instability is arrested in immortal cells which express telomerase activity. Embo. J. 11, 1921-1929 (1992).
  16. Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Exp. Cell. Res. 25, 585-621 (1961).
  17. Goetz, I. E., Moklebust, R., Warren, C. J. Effects of some antibiotics on the growth of human diploid skin fibroblasts in cell culture. In Vitro. 15 (2), 114-119 (1979).
  18. Coriell, L. L., Fogh, J. .. Methods of prevention of bacterial, fungal, and other contaminations. Contamination in Tissue Culture. , 29-49 (1973).
  19. Hambor, J. E. Bioreactor Design and Bioprocess Controls for Industrialized Cell Processing. Bioprocess Tech. Bull. 10 (6), 22-33 (2012).
  20. Abbot, A., Cyranoski, D. Biology’s new dimension. Nature. 424, 870-872 (2003).

Play Video

Cite This Article
Biesbrock, A. M., Powell, C. M., Hunter, W. B., Bextine, B. R. Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture. J. Vis. Exp. (91), e51953, doi:10.3791/51953 (2014).

View Video