Summary

Распространение<em> Homalodisca coagulata вирус-01</em> Через<em> Homalodisca vitripennis</em> Культура клеток

Published: September 25, 2014
doi:

Summary

Здесь мы приводим протокол для распространения Homalodisca vitripennis клетки и HoCV-1 в пробирке. Среду удаляли из HoCV-1 положительных культур и РНК, выделенная каждые 24 ч для 168 часов. Сотовый живучесть количественно путем окрашивания трипановым синим. Целые вирусные частицы были извлечены после инфицирования. Извлеченные РНК оценивали количественно путем Qrt-PCR.

Abstract

Стекловидный крыльями снайпер (Homalodisca vitripennis) является весьма vagile и многоядны насекомое найти по всему юго-западе США. Эти насекомые являются преобладающими векторы Xylella fastidiosa (X. fastidiosa), ксилемы ограниченной бактерия, которая является возбудителем болезни Пирса (PD) виноградной лозы. Болезнь Пирса является экономический ущерб; Таким образом, H. vitripennis стали мишенью для стратегии управления патоген. Dicistrovirus определены как Homalodisca coagulata вируса-01 (HoCV-01) была связана с повышенной смертностью в H. vitripennis населения. Потому что клетка-хозяин требуется для HoCV-01 репликации, культура клеток обеспечивает единую среду для целевого репликации, которая логистически и экономически ценным для производства биопестицидов. В этом исследовании, системы для широкомасштабного распространения H. vitripennis клетки через культуре ткани была разработана, рредоставление вирусную механизм репликации. HoCV-01 был извлечен из целых насекомых тела и использовали для инокуляции культурный H. vitripennis клетки при различных условиях. Культуральную среду удаляли каждые 24 ч в течение 168 часов, РНК экстрагировали и анализировали с Qrt-PCR. Клетки окрашивали трипановым синим и подсчитывали количественно клеток живучесть с использованием световой микроскопии. Целые вирусные частицы были извлечены до 96 часов после заражения, которое было время точка определена как до возникновения полный крах культуры клеток. Клетки также подвергаются флуоресцентной окраски и просматривать с помощью конфокальной микроскопии для исследования вирусной активности на F-актин привязанности и ядер целостности. Вывод этого исследования является то, что H. vitripennis клетки способны культивируются и используются для массового производства HoCV-01 на подходящем уровне, чтобы позволить производство биопестицида.

Introduction

Стекловидный крыльями снайпер (Homalodisca vitripennis Germar 1821) была определена в качестве основного вектора Xylella fastidiosa (X. fastidiosa), возбудителя болезни Пирса виноградной лозы (PD) в Северной Америке 1. Насекомое населения управления быстро стал основным направлением научных исследований в целях борьбы с этой страшной проблемы в виноградарско промышленности в Калифорнии и по всей южной части Соединенных Штатов. Положительным смысле, одноцепочечной РНК вируса, принадлежащий к семейству Dicistroviridae, Homalodisca вирус-01 coagulata (HoCV-01) был определен в дикой H. населения vitripennis и показано, что увеличение смертности в тех популяциях 2-4, в то время как понижение сопротивляемости насекомого к инсектицидам.

Разработка методов для эффективного заднего инфицированных H. vitripennis к взрослой жизни в лабораторных условиях было трудно, потому что <eм> H. vitripennis имеют различные сценические конкретных потребностей в питании, которые требуют различные растений-хозяев 5-8. Конкретные объекты обязаны задней живой H. vitripennis в США; Поэтому, культуры клеток является более экономичным и жизнеспособной альтернативой, а также все более важным для HoCV-01 обнаружения и репликации 2,9. В то время как основные методы для создания клеточных культур H. vitripennis описаны эти методы еще не были использованы для промышленного производства биологических средств защиты, таких как вирусы 2.

Общая цель из следующих процедур является создание высокой концентрации HoCV-01, пригодного для использования в качестве агента биологической борьбы. Вирусной репликации требуется живую клетку, поэтому успешно культивируя и оптимизации H. vitripennis культуры является жизненно важным для прогресса производства выгодные уровни вируса.

Protocol

1 Культура клеток ПРИМЕЧАНИЕ: Homalodisca vitripennis клеточные линии, установленные в лаборатории д-р Уэйн Хантер в Службы сельскохозяйственных исследований Министерства сельского хозяйства США (. Ft Pierce, FL США) были использованы для организации лаборатории запас, состоящий из…

Representative Results

Прикрепление клеток и рост наблюдался в течение 48 часов прохождения в малых и больших колбах культуры, из первичных культур и продолжающихся проходов. Роста фибробластов и развитие наблюдалось также в течение этого времени. Когда недавно посеянные Колбы нарушается до 48 часов, было вид…

Discussion

Рост беспокойства в отношении притока инвазивных сельскохозяйственных видов привели к увеличению спроса на новых методологий по защите от новых вредителей и патогенов. В центре внимания профилактике заболеваний и управления включает в себя управление патогенных векторов и было осн?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We would like to thank the Texas Pierce’s Disease Research and Education Program and USDA-APHIS for their funding support for this project. We would also like to thank Hema Kothari at the University of Texas Health Science Center at Tyler for her assistance with confocal microscopy.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Corning cell culture flasks Sigma Aldrich CLS430168 Surface area 25 cm2, canted neck, cap (plug seal)
Olympus DP30BW, IX2-SP, IX71 Olympus Inverted microscope and camera
Trypsin-EDTA solution Sigma Aldrich T4049 0.25%, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture, 2.5 g porcine trypsin and 0.2 g EDTA • 4Na per liter of Hanks′ Balanced Salt Solution with phenol red
Greiner CELLSTAR multiwell culture plates Sigma Aldrich M8937 48 wells (TC treated with lid)
DETCA  Sigma Aldrich 228680 Sodium diethyldithiocarbamate trihydrate
Corning bottle-top vacuum filter system Sigma Aldrich CLS431206 Cellulose acetate membrane, pore size 0.45 μm, membrane area 54.5 cm2, filter capacity 500 mL
Brij 52 Sigma Aldrich 388831 Polyethylene glycol hexadecyl ether
Phosphate buffer solution Sigma Aldrich P5244 Recieved as 100mM diluted to 10mM with sterile water
TRIzol LS  Life Technologies 10296-028
Agarose Sigma Aldrich A5304 For electrophoresis
Ethidium bromide Sigma Aldrich E7637 BioReagent, for molecular biology, powder
QIAquick Qiagen 28704
QuantiTect qRT-PCR kit  Qiagen 204243
4% paraformaldehyde  Sigma Aldrich P6148  Reagent grade, crystalline
PBS  Sigma Aldrich P5368 Phosphate buffered saline
Triton X-100  Sigma Aldrich X100
Bovine serum albumin (BSA) Sigma Aldrich A2153
Rhodamine red-conjugated phalloidin  Life Technologies R415 Rhodamine phalloidin is a high-affinity F-actin probe conjugated to the red-orange fluorescent dye, tetramethylrhodamine
DAPI  Sigma Aldrich D9542
ProLong Gold Antifade Reagent Life Technologies P36934
LSM510 Meta Confocal System  Carl Zeiss
LSM Zen 2007 Software Carl Zeiss
Grace’s Insect medium (supplemented, 1X) Sigma Aldrich G8142 H2G+ leafhopper medium component
L-histidine monohydrate Sigma Aldrich H8125 H2G+ leafhopper medium component
Medium 199 (10X) Sigma Aldrich M4530 H2G+ leafhopper medium component
Medium 1066 (1X) Sigma Aldrich C0422 H2G+ leafhopper medium component
Hank’s Balanced Salts (1X) Sigma Aldrich 51322C H2G+ leafhopper medium component
L-Glutamine (100X) Sigma Aldrich G3126 H2G+ leafhopper medium component
MEM, amino acid mix (50X) Sigma Aldrich 56419C H2G+ leafhopper medium component
1 M MgCl solution Sigma Aldrich M8266 H2G+ leafhopper medium component
Pen-Strep (w/ Glutamine) Sigma Aldrich G6784 H2G+ leafhopper medium component
Nystatin Sigma Aldrich N6261 H2G+ leafhopper medium component
Gentamycin Sigma Aldrich 46305 H2G+ leafhopper medium component
Dextrose Sigma Aldrich D9434 H2G+ leafhopper medium component
Fetal Bovine Serum Sigma Aldrich F2442 H2G+ leafhopper medium component

References

  1. Takiya, D. M., McKamey, S. H., Cavichioli, R. R. Validity of Homalodisca and of H. vitripennis as the Name for Glassy-winged Sharpshooter (Hemiptera: Cicadellidae: Cicadellinae). Ann. Entomol. Soc. Am. 99 (4), 648-655 (2006).
  2. Hunter, W. B., Katsar, C. S., Chaparro, J. X. Molecular analysis of capsid protein of Homalodisca coagulata Virus-1, a new leafhopper-infecting virus from the glassy-winged sharpshooter, Homalodisca coagulata. J. Insect Sci. 6 (28), 1-10 (2006).
  3. Hunnicutt, L. E., Hunter, W. B., Cave, R. D., Powell, C. A., Mozoruk, J. J. Genome sequence and molecular characterization of Homalodisca coagulata virus-1, a novel virus discovered in the glassy-winged sharpshooter (Hemiptera: Cicadellidae). Virology. 350 (1), 67-78 (2006).
  4. Hunnicutt, L. E., Mozoruk, J., Hunter, W. B., Crosslin, J. M., Cave, R. D., Powell, C. D. Prevalence and natural host range of Homalodisca coagulata virus-1 (HoCV-1). Virology. 153, 61-67 (2008).
  5. Jones, W. A., Setamou, M. Biology and Biometry of Sharpshooter Homalodisca coagulata (Homoptera) Cicadellidae) Reared on Cowpea. Ann. Entomol. Soc. Am. 98 (3), 322-328 (2005).
  6. Turner, W. F., Pollard, H. N. Life histories and behavior of five insect vectors of phony peach disease. US Dep. Agric. Tech. Bull. 1188, 1-32 (1959).
  7. Brodbeck, B. V., Andersen, P. C., Mizell, R. F. Utilization of primary nutrients by the polyphagous xylophage, Homalodisca coagulata, reared on single host species. Arch. Insect Biochem. Physiol. 32, 65-83 (1996).
  8. Brodbeck, B. V., Andersen, P. C., Mizell, R. F. Effects of total dietary nitrogen and nitrogen form on the development of xylophagous leafhoppers. Arch. Insect Biochem. Physiol. 42, 37-50 (1999).
  9. Kamita, S. G., Do, Z. N., Samra, A. I., Halger, J. R., Hammock, B. D. Characterization of Cell Lines Developed from the Glassy-winged Sharpshooter, Homalodisca coagulata (Hemiptera: Cicadellidae). In vitro Cell Dev.-An. 41, 149-153 (2005).
  10. Hunter, W. B. Medium for development of bee cell cultures (Apis mellifera: Hymenoptera: Apidae). In vitro Cell Dev.-An. 46 (2), 83-86 (2010).
  11. Bextine, B., Hunter, W., Marshall, P., Hail, D. Identification and whole extraction of Homalodisca coagulata-virus01. (HoCV-01) from Texas glassy-winged sharpshooter populations. , 9-12 (2009).
  12. Rhoades, D. J. Economics of baculovirus – insect cell production. Cytotechnology. 20, 291-297 (1996).
  13. Briske-Anderson, M. J., Finley, J. W., Newman, S. M. The influence of culture time and passage number on the morphological and physiological development of Caco-2 cells. P. Soc. Exp. Biol. Med. 214 (3), 248-257 (1997).
  14. Chin, L., et al. Deficiency Rescues the Adverse Effects of Telomere Loss and Cooperates with Telomere Dysfunction to Accelerate Carcinogenesis. Cell. 97 (4), 527-538 (1999).
  15. Counter, C. M., et al. Telomere shortening associated with chromosome instability is arrested in immortal cells which express telomerase activity. Embo. J. 11, 1921-1929 (1992).
  16. Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Exp. Cell. Res. 25, 585-621 (1961).
  17. Goetz, I. E., Moklebust, R., Warren, C. J. Effects of some antibiotics on the growth of human diploid skin fibroblasts in cell culture. In Vitro. 15 (2), 114-119 (1979).
  18. Coriell, L. L., Fogh, J. .. Methods of prevention of bacterial, fungal, and other contaminations. Contamination in Tissue Culture. , 29-49 (1973).
  19. Hambor, J. E. Bioreactor Design and Bioprocess Controls for Industrialized Cell Processing. Bioprocess Tech. Bull. 10 (6), 22-33 (2012).
  20. Abbot, A., Cyranoski, D. Biology’s new dimension. Nature. 424, 870-872 (2003).

Play Video

Cite This Article
Biesbrock, A. M., Powell, C. M., Hunter, W. B., Bextine, B. R. Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture. J. Vis. Exp. (91), e51953, doi:10.3791/51953 (2014).

View Video