רביה של<em> וירוס-01 coagulata Homalodisca</em> דרך<em> Homalodisca vitripennis</em> תרבות תא
Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול להפיץ תאי vitripennis Homalodisca וHoCV-1 במבחנה. בינוני הוסר מHoCV-1 תרבויות חיוביות וRNA שחולץ כל שעה 24 ל168 שעה. שרידות תא הייתה לכמת ידי מכתים trypan הכחול. חלקיקי נגיף שלמים חולצו לאחר פגיעה. RNA שחולץ היה לכמת ידי qRT-PCR.
Abstract
הצלף מזוגגת מכונף (Homalodisca vitripennis) הוא חרקים vagile וpolyphagous מאוד למצוא בכל רחבי מערב ארצות הברית. חרקים אלה הם הווקטורים העיקריים של (fastidiosa X.) fastidiosa Xylella, חיידק מוגבל עצה שהוא הסוכן סיבתי למחלתו של פירס (PD) של גפן. מחלתו של פירס היא מבחינה כלכלית מזיקה; וכך, ה ' vitripennis הפך יעד לאסטרטגיות ניהול הפתוגן. Dicistrovirus זוהה כוירוס-01 coagulata Homalodisca (HoCV-01) נמצא קשור לסיכון מוגבר לתמותה בח אוכלוסיות vitripennis. בגלל נדרש תא מארח עבור שכפול HoCV-01, תרבית תאים מספקת סביבה אחידה לשכפול ממוקד שהוא מבחינה לוגיסטית וכלכלי רב ערך לייצור biopesticide. במחקר זה, מערכת להפצה בקנה מידה גדולה של ה ' תאי vitripennis באמצעות תרבית רקמה פותחו, עמ 'roviding מנגנון שכפול נגיפי. HoCV-01 היה שחולץ מן החרקים בכל גוף ומשמש ללחסן ה התרבותית תאי vitripennis ברמות שונות. מדיום התרבות הוסר כל שעה 24 ל168 שעה, RNA חילוץ וניתח עם qRT-PCR. תאים הוכתמו trypan הכחול ונספרו לכמת שרידות תא באמצעות מיקרוסקופ אור. חלקיקי נגיף שלמים הוצאו עד 96 שעות לאחר הדבקה, שהייתה נקודת הזמן שנקבעה להיות לפני קריסה מוחלטת תרבית תאים התרחשה. תאים גם היו נתונים לצביעת ניאון ונצפו באמצעות מיקרוסקופ confocal לחקור פעילות נגיפית בשלמות התקשרות וגרעיני F-אקטין. המסקנה של מחקר זה היא כי ה ' תאי vitripennis מסוגלים להיות מתורבת ומשמש לייצור המוני של HoCV-01 ברמה מתאימה שיאפשר ייצור של biopesticide.
Introduction
הצלף מזוגגת המכונף (Homalodisca vitripennis Germar 1821) זוהה כווקטור העיקרי של fastidiosa (fastidiosa X.) Xylella, הסוכן סיבתי של מחלת פירס של גפן (PD) בצפון אמריקה 1. ניהול אוכלוסיית חרקים הפך במהירות למוקד של מחקר כדי להילחם בבעיה הרסנית הזאת לתעשיית גידול הגפנים בקליפורניה וברחבי ארצות הברית הדרום. חיובי תחושה, וירוס RNA חד גדילים השייכת למשפחה Dicistroviridae, Homalodisca-01 וירוס (HoCV-01) זוהה coagulata בה הפראית אוכלוסיות vitripennis והוצג להגדלת תמותה באוכלוסיות אלה 2-4, תוך הפחתת ההתנגדות של החרקים לחומרי הדברה.
פיתוח שיטות ליעילות אחורי נגוע ח vitripennis לבגרות במעבדת הגדרה היה קשה משום ש <eמ '> H. יש לי vitripennis הצרכים בשלב מסוים שונים תזונתיים הדורשים מגוון רחב של צמחי מארח 5-8. מתקנים ספציפיים נדרשים לה 'חי אחורי vitripennis בארצות הברית; לכן, תרבית תאים היא חסכונית יותר וחלופה, כמו גם חיונית יותר ויותר לHoCV-01 זיהוי ושכפול 2,9. בעוד שיטות בסיסיות להקמת תרביות תאים של ה vitripennis מתוארים, שיטות אלה עדיין לא נוצלו לייצור מסחרי של סוכני הדברה ביולוגיים, כגון וירוסים 2.
המטרה הכוללת של ההליכים הבאים היא לייצר ריכוז גבוה של HoCV-01 מתאים לניצול כסוכן הדברה ביולוגי. שכפול נגיפי דורש תא חי, וזאת הסיבה שהצלחת טיפוח וייעול ה ' תרבויות vitripennis היא חיוניות להתקדמות של הפקת רמות רווחיות של וירוס.
Protocol
Representative Results
Discussion
חששות עולים בנוגע לזרם של מינים חקלאיים פולשני שיובילו לגידול בביקוש למתודולוגיות חדשות להגנה מפני מזיקים ופתוגנים המתעוררים. מוקד מניעת מחלות וניהול כרוך בניהול של וקטורי הפתוגן והיה היעד העיקרי של מחקר זה. כלכלה לשחק תפקיד חיוני בהחלטה לייצר סוג זה של biopesticide ל…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank the Texas Pierce’s Disease Research and Education Program and USDA-APHIS for their funding support for this project. We would also like to thank Hema Kothari at the University of Texas Health Science Center at Tyler for her assistance with confocal microscopy.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Corning cell culture flasks | Sigma Aldrich | CLS430168 | Surface area 25 cm2, canted neck, cap (plug seal) |
| Olympus DP30BW, IX2-SP, IX71 | Olympus | Inverted microscope and camera | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma Aldrich | T4049 | 0.25%, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture, 2.5 g porcine trypsin and 0.2 g EDTA • 4Na per liter of Hanks′ Balanced Salt Solution with phenol red |
| Greiner CELLSTAR multiwell culture plates | Sigma Aldrich | M8937 | 48 wells (TC treated with lid) |
| DETCA | Sigma Aldrich | 228680 | Sodium diethyldithiocarbamate trihydrate |
| Corning bottle-top vacuum filter system | Sigma Aldrich | CLS431206 | Cellulose acetate membrane, pore size 0.45 μm, membrane area 54.5 cm2, filter capacity 500 mL |
| Brij 52 | Sigma Aldrich | 388831 | Polyethylene glycol hexadecyl ether |
| Phosphate buffer solution | Sigma Aldrich | P5244 | Recieved as 100mM diluted to 10mM with sterile water |
| TRIzol LS | Life Technologies | 10296-028 | |
| Agarose | Sigma Aldrich | A5304 | For electrophoresis |
| Ethidium bromide | Sigma Aldrich | E7637 | BioReagent, for molecular biology, powder |
| QIAquick | Qiagen | 28704 | |
| QuantiTect qRT-PCR kit | Qiagen | 204243 | |
| 4% paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | Reagent grade, crystalline |
| PBS | Sigma Aldrich | P5368 | Phosphate buffered saline |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A2153 | |
| Rhodamine red-conjugated phalloidin | Life Technologies | R415 | Rhodamine phalloidin is a high-affinity F-actin probe conjugated to the red-orange fluorescent dye, tetramethylrhodamine |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | |
| ProLong Gold Antifade Reagent | Life Technologies | P36934 | |
| LSM510 Meta Confocal System | Carl Zeiss | ||
| LSM Zen 2007 Software | Carl Zeiss | ||
| Grace’s Insect medium (supplemented, 1X) | Sigma Aldrich | G8142 | H2G+ leafhopper medium component |
| L-histidine monohydrate | Sigma Aldrich | H8125 | H2G+ leafhopper medium component |
| Medium 199 (10X) | Sigma Aldrich | M4530 | H2G+ leafhopper medium component |
| Medium 1066 (1X) | Sigma Aldrich | C0422 | H2G+ leafhopper medium component |
| Hank’s Balanced Salts (1X) | Sigma Aldrich | 51322C | H2G+ leafhopper medium component |
| L-Glutamine (100X) | Sigma Aldrich | G3126 | H2G+ leafhopper medium component |
| MEM, amino acid mix (50X) | Sigma Aldrich | 56419C | H2G+ leafhopper medium component |
| 1 M MgCl solution | Sigma Aldrich | M8266 | H2G+ leafhopper medium component |
| Pen-Strep (w/ Glutamine) | Sigma Aldrich | G6784 | H2G+ leafhopper medium component |
| Nystatin | Sigma Aldrich | N6261 | H2G+ leafhopper medium component |
| Gentamycin | Sigma Aldrich | 46305 | H2G+ leafhopper medium component |
| Dextrose | Sigma Aldrich | D9434 | H2G+ leafhopper medium component |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F2442 | H2G+ leafhopper medium component |
References
- Takiya, D. M., McKamey, S. H., Cavichioli, R. R. Validity of Homalodisca and of H. vitripennis as the Name for Glassy-winged Sharpshooter (Hemiptera: Cicadellidae: Cicadellinae). Ann. Entomol. Soc. Am. 99 (4), 648-655 (2006).
- Hunter, W. B., Katsar, C. S., Chaparro, J. X. Molecular analysis of capsid protein of Homalodisca coagulata Virus-1, a new leafhopper-infecting virus from the glassy-winged sharpshooter, Homalodisca coagulata. J. Insect Sci. 6 (28), 1-10 (2006).
- Hunnicutt, L. E., Hunter, W. B., Cave, R. D., Powell, C. A., Mozoruk, J. J. Genome sequence and molecular characterization of Homalodisca coagulata virus-1, a novel virus discovered in the glassy-winged sharpshooter (Hemiptera: Cicadellidae). Virology. 350 (1), 67-78 (2006).
- Hunnicutt, L. E., Mozoruk, J., Hunter, W. B., Crosslin, J. M., Cave, R. D., Powell, C. D. Prevalence and natural host range of Homalodisca coagulata virus-1 (HoCV-1). Virology. 153, 61-67 (2008).
- Jones, W. A., Setamou, M. Biology and Biometry of Sharpshooter Homalodisca coagulata (Homoptera) Cicadellidae) Reared on Cowpea. Ann. Entomol. Soc. Am. 98 (3), 322-328 (2005).
- Turner, W. F., Pollard, H. N. Life histories and behavior of five insect vectors of phony peach disease. US Dep. Agric. Tech. Bull. 1188, 1-32 (1959).
- Brodbeck, B. V., Andersen, P. C., Mizell, R. F. Utilization of primary nutrients by the polyphagous xylophage, Homalodisca coagulata, reared on single host species. Arch. Insect Biochem. Physiol. 32, 65-83 (1996).
- Brodbeck, B. V., Andersen, P. C., Mizell, R. F. Effects of total dietary nitrogen and nitrogen form on the development of xylophagous leafhoppers. Arch. Insect Biochem. Physiol. 42, 37-50 (1999).
- Kamita, S. G., Do, Z. N., Samra, A. I., Halger, J. R., Hammock, B. D. Characterization of Cell Lines Developed from the Glassy-winged Sharpshooter, Homalodisca coagulata (Hemiptera: Cicadellidae). In vitro Cell Dev.-An. 41, 149-153 (2005).
- Hunter, W. B. Medium for development of bee cell cultures (Apis mellifera: Hymenoptera: Apidae). In vitro Cell Dev.-An. 46 (2), 83-86 (2010).
- Bextine, B., Hunter, W., Marshall, P., Hail, D. Identification and whole extraction of Homalodisca coagulata-virus01. (HoCV-01) from Texas glassy-winged sharpshooter populations. , 9-12 (2009).
- Rhoades, D. J. Economics of baculovirus – insect cell production. Cytotechnology. 20, 291-297 (1996).
- Briske-Anderson, M. J., Finley, J. W., Newman, S. M. The influence of culture time and passage number on the morphological and physiological development of Caco-2 cells. P. Soc. Exp. Biol. Med. 214 (3), 248-257 (1997).
- Chin, L., et al. Deficiency Rescues the Adverse Effects of Telomere Loss and Cooperates with Telomere Dysfunction to Accelerate Carcinogenesis. Cell. 97 (4), 527-538 (1999).
- Counter, C. M., et al. Telomere shortening associated with chromosome instability is arrested in immortal cells which express telomerase activity. Embo. J. 11, 1921-1929 (1992).
- Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Exp. Cell. Res. 25, 585-621 (1961).
- Goetz, I. E., Moklebust, R., Warren, C. J. Effects of some antibiotics on the growth of human diploid skin fibroblasts in cell culture. In Vitro. 15 (2), 114-119 (1979).
- Coriell, L. L., Fogh, J. .. Methods of prevention of bacterial, fungal, and other contaminations. Contamination in Tissue Culture. , 29-49 (1973).
- Hambor, J. E. Bioreactor Design and Bioprocess Controls for Industrialized Cell Processing. Bioprocess Tech. Bull. 10 (6), 22-33 (2012).
- Abbot, A., Cyranoski, D. Biology’s new dimension. Nature. 424, 870-872 (2003).
