These studies report on reversible attachment of adenoviral gene vectors to coatless metal surfaces of stents and model mesh disks. Sustained release of transduction-competent viral particles contingent upon hydrolysis of cross-linkers used for vector immobilization results in a durable site-specific transgene expression in vascular cells and in stented arteries.
Stent restenoz yaygın koroner ve periferik arter kritik daralmış kesimleri ile yeniden kurmak kan akışı için kullanılan stent tabanlı revaskülarizasyon işlemlerinin önemli bir komplikasyon sunar. Alternatif bir strateji sunmak anti-restenotik aktiviteye sahip genlerin ayarlanabilir serbest bırakabilen Endovasküler stentler halen ilaç salınımlı stentler kullanılan. Tipik olarak, vektörün fiziksel olarak yakalanmalarında için kullanılan polimer kaplamalarla ilişkili aşırı bir enflamatuvar yanıtı kaçınarak klinik kullanımlarını elde etmek amacıyla, gen salınımlı stent, stent hareketsizleştirilmiş gen vektörü serbest bırakılması ve damar siteye özgü iletimi öngörülebilir kinetiklerle gösterirler. Bu çalışma, bisfosfonat (PABT) hidroliz olabilen bir çapraz bağlayıcıların (HC) ile paslanmaz çelik yüzeyi uğratılmış polialilamin için adenoviral parçacıklarının geri bağlanmasına dayalı stentlere adenoviral vektörlerin gen coatless bağlanması için ayrıntılı bir yöntem anlatılmaktadır. Bir aile5 ile 50 gün arasında değişen zincir içinde bir ester hidroliz reaksiyonuna ortalama t 1/2 ile iki işlevli (amın ve tiol-reaktif) HC stent vektör bağlamak için kullanıldı. Vektör hareketsizleştirme prosedürü, 9 saat içinde gerçekleştirilir ve çeşitli adımlardan oluşur: PABT (4 saat) bir sulu çözelti içinde metal numunelerin 1) inkübasyon; Tris (2-karboksietil) fosfin (20 dk) ile PABT yüklü tiyol gruplarının 2) korumanın giderilmesi; Pırıdıldıtıo (PDT) grup (2 saat) ile derive edilmiş polietilenimin ile reaksiyona sokulması ile numune metal yüzeyin tiol reaktif kapasite 3) genişlemesi; Ditiyotreitol (10 dakika) ile tioller PDT grupların 4) dönüştürülmesi; HC (1 saat) ile adenovirüslerin 5) değiştirilmesi; Boyut dışlama sütun kromatografisi (15 dakika) ve tiollenmiş çelik yüzeye (1 saat), tiyol-reaktif bir adenoviral parçacıkların 7) immobilizasyon ile modifiye edilmiş adenovirüs partiküllerinin 6), saflaştırma. Bu teknik, stentlerin ötesinde geniş potansiyel uygulanabilirliği vardırİmplante edilen yabancı maddelerin ara-yüz hücrelere tabaka aracılı gen aktarımı yoluyla biyolojik uyumluluğunun geliştirmek için biyoprotez cihazların yüzeyi mühendisliği kolaylaştırarak.
Bir tedavi yöntemi olarak gen tedavisinin etkinliği gen terapi vektörleri 1,2 fakir hedefleme kapasitesi ile engellenmektedir. Hedef bölgede transgen ekspresyonunun alt terapötik seviyelerinde uygun hedefleme sonuçları eksikliği ve vektör ve kodlanmış bir terapötik ürün 4, her iki karşı bağışıklık karşılıklarının monte edilmesi için sorumlu olanlar da dahil olmak üzere, hedef olmayan organlar 3 e vektörleri yayılmasına yol açar 5. Bir potansiyel transdüksiyon karışıklık dengelemek ve hedefleme kan ve lenf yolu ile serbest yayılmasını önleyen bir formunda, istenen konuma gen vektörlerin tanıtmaktır teşvik etmek anlamına gelir. Tipik haliyle, bu çabalar fiziksel th tutulmasıyla da enjeksiyon yerinde geçici olarak sürdürülmesi gen vektörlerin sahip olan fibrin, kollajen veya hiyalüronik asit hidrojel matrisler 6-10 ile karıştırılır, viral veya viral olmayan vektörler ya da lokal olarak oluşan enjekte edilebilir bir dağıtım sistemlerine bağlıBir polimerik ağ-em.
Gen tedavisi için lokalize bir diğer genel olarak kabul edilen bir paradigma implante prostetik cihazların 11,12 yüzeyinde gen vektörlerin immobilizasyon kullanmaktadır. Kalıcı tıbbi implantlar (endovasküler, bronş, ürolojik ve gastrointestinal stentler, kalp pilleri, yapay eklemler, cerrahi ve jinekolojik kafesleri, vb.) Hastaların 13 on milyonlarca yıllık kullanılmaktadır. Genellikle etkili iken, bu cihazlar yetersiz güncel tıbbi uygulamalar 14-17 tarafından kontrol edilir komplikasyonlara yatkındır. Implante edilebilir protez cihazlar lokalize gen tedavi için proxy platformları olarak hizmet için eşsiz bir fırsat sunuyoruz. Farmakokinetik açısından, thei kinetiklerini implant / doku arayüzde gen vektörlerin yüksek lokal konsantrasyonlarda alınmasında ve yavaşlayan gen vektörler sonuç nispeten düşük giriş dozlarda tıbbi implantlar yüzey türetilmesi kaynaktanBu konumdan r eliminasyon. Hedef alınan hücre popülasyonu ile uzun süreli bir ikamet sonucu ve daha iyi alınmasıyla olarak, vektör immobilizasyon gen vektörü yayılmasını minimize eder. Böylece, hedef dışı dokuların istenmeyen aşılama azalır.
(Aynı zamanda alt-tabaka-aracılı gen aktarımı ya da katı faz gen aktarımı olarak adlandırılır) implante biyomalzeme gen vektörlerin yüzey birleştirme kullanılarak hücre kültürü ve hayvan deneylerinde uygulanmıştır hem spesifik (antikor-antijen 18-20, avidin-biyotin 21,22) ve 23-26 (şarj, van der Waals) etkileşimler spesifik olmayan. Yüzey ile aşırı güçlü bağlar, hedef hücreler tarafından vektör içselleştirme engel yana implante edilmiş cihazın yüzeyine vektörlerin kovalent bağlanması, daha önce fonksiyonel olmayan olarak kabul edilmiştir. Yakın zamanda, bu sınırlama tet olarak kullanılan hidrolize edilebilir kendiliğinden çapraz bağlayıcı kullanımı ile aşılabilir olduğu gösterilmiştiradenoviral vektör 27,28 arasında stent ve kapsid proteinlerinin değiştirilmiş metal yüzey arasında onun. Ayrıca, taşıyıcıda salım hızı ve in vitro ve in vivo olarak transgen ekspresyonunun zaman seyri hidrolizi 28 farklı kinetik sergileyen hidroliz olabilen bir çapraz-bağlayıcıların kullanımı ile modüle edilebilir.
Bu makale aktif metal yüzeye adenoviral vektörlerin tersine çevrilebilir kovalent bağlanması için ayrıntılı bir protokol sağlamakta ve anjiyoplasti, stent sıçan şahdamarı modelinde kültürlenmiş düz kas ve endotelyal hücrelerin in vivo ve in vitro olarak takip eden transdüksiyon olayları incelemek için uygun bir deney düzeneği getirmektedir .
Sunulan protokol paslanmaz çelik yüzeyleri coatless için adenoviral vektörlerin geri dönüşümlü eki yoluyla elde tabaka aracılı gen aktarımı için operasyonel bir yöntem açıklanır. Vasküler restenoz stent dayalı gen terapisi için özel olarak geliştirilmiş olup, bu teknik biyomateryaller, biyomedikal implant ve gen terapisi alanlarında çok daha geniş bir uygulama alanı vardır.
Sunulan çalışmalar sadece bir prototip, metal alt tabaka olarak paslanmaz çelik …
The authors have nothing to disclose.
The authors do not have competing financial interests to disclose.
316 stainless steel mesh disks | Electon Microscopy Sciences | E200-SS | |
Generic 304-grade stainless steel stents | Laserage | custom order | |
AdeGFP | University of Pennsylvania Vector Core | AD-5-PV0504 | |
AdLuc | University of Pennsylvania Vector Core | AD-5-PV1028 | |
AdEMPTY | University of Pennsylvania Vector Core | A858 | |
Cy3(NHS)2 | GE Healthcare | PA23000 | |
Sepharose 6B | Sigma-Aldrich | 6B100-500ML | |
UV 96-well plates | Costar | 3635 | |
Fluorometry 96-well plates | Costar | 3915 | |
Cell culture 96-well plates | Falcon | 353072 | |
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP ) | Pierce Thermo Scientific | 20490 | |
dithiothreitol (DTT) | Pierce Thermo Scientific | 20290 | |
sulfo-LC-SPDP | Pierce Thermo Scientific | 21650 | |
Spectrophotometer | Molecular Devices | SpectraMax 190 | |
Spectrofluorometer | Molecular Devices | SpectraMax Gemini EM | |
Orbital shaker incubator | VWR | 1575R | |
Horizontal airflow oven | Shel Lab | 1350 FM | |
Centra-CL2 centrifuge | International Equipment Company | 426 | |
Digital vortex mixerer | Fisher Thermo Scientific | 02-215-370 | |
Eclipse TE300 fluorescence microscope | Nikon | TE300 | |
DC 500 CCD camera | Leica | DC-500 | |
7500 Real-Time PCR system | Applied Biosystems | not available | |
IVIS Spectrum bioluminescence station | Perkins-Elmer | not available | |
EDTA dipotassium salt | Sigma-Aldrich | ED2P | |
Bovine serum albumin fraction V (BSA) | Fisher Thermo Scientific | BP1600-100 | |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
Dumont forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
A10 cell line | ATCC | CRL-1476 | |
Bovine aortic endothelial cells | Lonza | BW-6002 | |
Luciferin, potassium salt | Gold Biotechnology | LUCK-1Ge | |
Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443-250G | |
PBS without calcium and magnesium | Gibco | 14190-136 | |
Fetal bovine serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
Penicillin/Streptomycin solution | Gibco | 11540-122 | |
DMEM, high glucose | Corning cellgro | 10-013-CV | |
0.25% Trypsin/EDTA | Gibco | 25200-056 | |
QIAamp DNA micro kit | Qiagen | 56304 | |
Power Sybr Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
MicroAmp Optical 96-well Reaction Plate | Applied Biosystems | N8010560 | |
MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems | 4360954 | |
Cephazolin | Apotex | not available | |
Loxicom (Meloxicam) | Norbrook | not available | |
Heparin sodium | APP Pharmaceuticals | not available | |
Ketavet (Ketamine) | VEDCO | not available | |
Anased (Xylazine) | Lloid | not available | |
Forane (Isoflurane) | Baxter | not available | |
Curved Moria iris forceps | Fine Science tools | 11370-31 | |
Curved extra-fine Graefe forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | |
Fine scissors – ToughCut | Fine Science Tools | 14058-09 | |
Surgical scissors | Fine Science Tools | 14101-14 | |
Vicryl suture (5-0) | Ethicon | J385 | |
Suture thread (4/0 silk) | Fine Science Tools | 18020-40 | |
Michel suture clips | Fine Science Tools | 12040-02 | |
Wound dilator (Lancaster eye specula) | KLS Martin | 34-149-07 | |
Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
Michel suture clip applicator | Fine Science Tools | 112028-12 | |
Insyte Autoguard 24G IV catheter | Beckton-Dickinson | 381412 | |
2F Fogarty catheter | Edwards Lifesciences | 120602F | |
Teflon tubing | Vention | 041100BST | |
PTA catheter | NuMed | custom order | |
Gauze pads | Kendall Healthcare | 9024 | |
Cotton applicators | Solon Manufacturing | WOD1003 | |
Saline | Baxter | 281321 | |
10 ml syringe (Luer-Lok) | Beckton-Dickinson | 309604 | |
1 ml syringe (Luer-Lok) | Beckton-Dickinson | 309628 | |
Clippers with #40 blade | Oster | 78005-314 | |
Transpore surgical tape | 3M | MM 15271 | |
Puralube vet ointment | Pharmaderm | not available |