These studies report on reversible attachment of adenoviral gene vectors to coatless metal surfaces of stents and model mesh disks. Sustained release of transduction-competent viral particles contingent upon hydrolysis of cross-linkers used for vector immobilization results in a durable site-specific transgene expression in vascular cells and in stented arteries.
In-stent restenose weer een belangrijke complicatie van stent revascularisatie procedures schaal gebruikt voor herstel van de bloedstroom door kritisch vernauwde delen van coronaire en perifere arteriën. Endovasculaire stents staat afstembare vrijlating van genen met anti-restenotische activiteit kan een alternatieve strategie te presenteren aan momenteel gebruikte drug-eluting stents. Om klinische vertaling bereiken, moet gen eluerende stents vertonen voorspelbare kinetiek van stent geïmmobiliseerde genvector afgifte en plaatsspecifieke transductie van vasculatuur, een al te grote ontstekingsreactie doorgaans geassocieerd met het polymeer coatings die fysieke invangen van de vector. Dit artikel beschrijft een gedetailleerde methodologie voor coatless aanbinden van adenovirale vectoren genen om stents op basis van een omkeerbare binding van de adenovirale deeltjes polyallylamine bisfosfonaat (PABT) -modified roestvrijstalen oppervlak via hydroliseerbare cross-linkers (HC). Een familie vanbifunctionele (amine en thiol-reactief) HC met een gemiddelde t 1/2 van de in-keten ester hydrolyse variërend tussen 5 en 50 dagen werden gebruikt om de vector te verbinden met de stent. De vector immobilisatie procedure wordt typisch uitgevoerd binnen 9 uur en omvat verschillende stappen: 1) incubatie van de metalen monsters in een waterige oplossing van PABT (4 uur); 2) ontscherming van thiolgroepen in PABT geïnstalleerd tris (2-carboxyethyl) fosfine (20 min); 3) uitbreiding van thiol reactieve capaciteit van het metaaloppervlak door reactie met polyethyleenimine de monsters gederivatiseerd met pyridyldithio (PDT) groepen (2 uur); 4) omzetting van PDT groepen om thiolen met dithiothréitol (10 min); 5) modificatie van adenovirussen met HC (1 uur); 6) zuivering van gemodificeerde adenovirale deeltjes per grootte-uitsluiting chromatografie (15 min) en 7) immobilisatie van thiol-reactieve adenovirale deeltjes op het gethioleerde staaloppervlak (1 hr). Deze techniek heeft een brede potentiële toepasbaarheid verder stents,door het faciliteren van oppervlakte-engineering van bioprothetische apparatuur naar de biocompatibiliteit te verbeteren door middel van het substraat-gemedieerde gen-levering aan de cellen interfacing de geïmplanteerde vreemd materiaal.
De effectiviteit van gentherapie als een therapeutische modaliteit wordt gehinderd door de slechte targeting vermogen van gentherapie vectoren 1,2. Het ontbreken van een goede targeting resultaten in sub-therapeutische niveaus van transgene expressie op de doellocatie en leidt tot een brede verspreiding van vectoren voor niet-doelwit organen 3, met inbegrip van degenen die verantwoordelijk zijn voor het monteren van de immuunrespons tegen zowel de vector en gecodeerde therapeutisch product 4, 5. Een mogelijk middel om de promiscuïteit van transductie te compenseren en te bevorderen targeting is genvectoren voeren op de gewenste locatie in een vorm die hun vrije verspreiding uitsluit via bloed en lymfe. Typisch deze inspanningen steunen op een lokaal injecteerbare afgiftesystemen bestaande uit ofwel virale of niet-virale vectoren gemengd met fibrine, collageen of hyaluronzuur hydrogel matrices 6-10 die in staat tijdelijk ondersteunen genvectoren op de injectieplaats door het fysisch invangen them in een polymeer netwerk.
Een ander algemeen geaccepteerd model voor gelokaliseerde gentherapie gebruikt immobilisatie van genvectoren op het oppervlak van geïmplanteerde prothesen 11,12. Permanente medische implantaten (endovasculaire, bronchiale, urologische en gastro-intestinale stents, pacemakers, kunstgewrichten, chirurgische en gynaecologische mazen, enz.) Worden jaarlijks gebruikt in de tientallen miljoenen patiënten 13. Terwijl over het algemeen effectief, deze apparaten zijn gevoelig voor complicaties die onvoldoende onder controle is door de huidige medische praktijk 14-17. Implanteerbare prothesen presenteren een unieke kans om te dienen als proxy platforms voor gelokaliseerde gentherapie behandeling. Vanuit de farmacokinetische oogpunt, oppervlakte derivaatvorming van medische implantaten met een relatief lage input doses genvectoren resultaten in het bereiken van zowel hoge lokale concentraties van genvectoren op het implantaat / weefsel-interface en het vertragen van de kinetiek van their eliminatie van deze locatie. Als gevolg van langdurig verblijf en een verhoogde opname van de beoogde celpopulatie vector immobilisatie minimaliseert verspreiding van het gen vector. Dus de onbedoelde inoculatie van niet-doelwit weefsels wordt verminderd.
Oppervlak aanbinden van genvectoren op implanteerbare biomaterialen (ook genoemd als-substraat gemedieerde gen-levering of vaste fase gentherapie) is in celcultuur en dierproeven uitgevoerd met behulp van zowel specifieke (antigeen-antilichaam 18-20, avidine-biotine 21,22) en aspecifieke 23-26 (kosten, van der Waals) interactie. De covalente binding van vectoren om het oppervlak van de geïmplanteerde inrichting is eerder beschouwd als niet-functioneel door de te sterke bindingen met het oppervlak beletsel vector internalisatie door doelcellen. Onlangs werd aangetoond dat deze beperking kan worden overwonnen door het gebruik van spontaan hydrolyseerbare vernettingsmiddel gebruikt als het tethers tussen het gemodificeerde metalen oppervlak van de stent en de capside-eiwitten van de adenovirale vector 27,28. Bovendien kan de vector afgiftesnelheid en tijdsduur van transgene expressie in vitro en in vivo worden gemoduleerd met gebruik van hydrolyseerbare verknopingsmiddelen vertonen verschillende kinetiek van hydrolyse 28.
Dit document verschaft een gedetailleerd protocol voor het omkeerbare covalente binding van adenovirale vectoren aan geactiveerde metalen oppervlak voor een nuttige experimentele opstelling voor het bestuderen daaropvolgende transductie in vitro in gekweekte gladde spiercellen en endotheliale cellen en in vivo in de rat model carotis angioplastiek of stent .
De gepresenteerde protocol beschrijft een operationele methode voor het substraat gemedieerde gentherapie bereikt door omkeerbare bevestiging van adenovirale vectoren van roestvaststalen oppervlakken coatless. Terwijl ontwikkeld voor specifieke doel-stent gentherapie van vasculaire restenose, deze techniek heeft veel bredere toepassingen op het gebied van biomaterialen, biomedische implantaten en gentherapie.
Hoewel gepresenteerd studies hebben uitsluitend gebruikt roestvrij staal als …
The authors have nothing to disclose.
The authors do not have competing financial interests to disclose.
316 stainless steel mesh disks | Electon Microscopy Sciences | E200-SS | |
Generic 304-grade stainless steel stents | Laserage | custom order | |
AdeGFP | University of Pennsylvania Vector Core | AD-5-PV0504 | |
AdLuc | University of Pennsylvania Vector Core | AD-5-PV1028 | |
AdEMPTY | University of Pennsylvania Vector Core | A858 | |
Cy3(NHS)2 | GE Healthcare | PA23000 | |
Sepharose 6B | Sigma-Aldrich | 6B100-500ML | |
UV 96-well plates | Costar | 3635 | |
Fluorometry 96-well plates | Costar | 3915 | |
Cell culture 96-well plates | Falcon | 353072 | |
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP ) | Pierce Thermo Scientific | 20490 | |
dithiothreitol (DTT) | Pierce Thermo Scientific | 20290 | |
sulfo-LC-SPDP | Pierce Thermo Scientific | 21650 | |
Spectrophotometer | Molecular Devices | SpectraMax 190 | |
Spectrofluorometer | Molecular Devices | SpectraMax Gemini EM | |
Orbital shaker incubator | VWR | 1575R | |
Horizontal airflow oven | Shel Lab | 1350 FM | |
Centra-CL2 centrifuge | International Equipment Company | 426 | |
Digital vortex mixerer | Fisher Thermo Scientific | 02-215-370 | |
Eclipse TE300 fluorescence microscope | Nikon | TE300 | |
DC 500 CCD camera | Leica | DC-500 | |
7500 Real-Time PCR system | Applied Biosystems | not available | |
IVIS Spectrum bioluminescence station | Perkins-Elmer | not available | |
EDTA dipotassium salt | Sigma-Aldrich | ED2P | |
Bovine serum albumin fraction V (BSA) | Fisher Thermo Scientific | BP1600-100 | |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
Dumont forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
A10 cell line | ATCC | CRL-1476 | |
Bovine aortic endothelial cells | Lonza | BW-6002 | |
Luciferin, potassium salt | Gold Biotechnology | LUCK-1Ge | |
Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443-250G | |
PBS without calcium and magnesium | Gibco | 14190-136 | |
Fetal bovine serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
Penicillin/Streptomycin solution | Gibco | 11540-122 | |
DMEM, high glucose | Corning cellgro | 10-013-CV | |
0.25% Trypsin/EDTA | Gibco | 25200-056 | |
QIAamp DNA micro kit | Qiagen | 56304 | |
Power Sybr Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
MicroAmp Optical 96-well Reaction Plate | Applied Biosystems | N8010560 | |
MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems | 4360954 | |
Cephazolin | Apotex | not available | |
Loxicom (Meloxicam) | Norbrook | not available | |
Heparin sodium | APP Pharmaceuticals | not available | |
Ketavet (Ketamine) | VEDCO | not available | |
Anased (Xylazine) | Lloid | not available | |
Forane (Isoflurane) | Baxter | not available | |
Curved Moria iris forceps | Fine Science tools | 11370-31 | |
Curved extra-fine Graefe forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | |
Fine scissors – ToughCut | Fine Science Tools | 14058-09 | |
Surgical scissors | Fine Science Tools | 14101-14 | |
Vicryl suture (5-0) | Ethicon | J385 | |
Suture thread (4/0 silk) | Fine Science Tools | 18020-40 | |
Michel suture clips | Fine Science Tools | 12040-02 | |
Wound dilator (Lancaster eye specula) | KLS Martin | 34-149-07 | |
Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
Michel suture clip applicator | Fine Science Tools | 112028-12 | |
Insyte Autoguard 24G IV catheter | Beckton-Dickinson | 381412 | |
2F Fogarty catheter | Edwards Lifesciences | 120602F | |
Teflon tubing | Vention | 041100BST | |
PTA catheter | NuMed | custom order | |
Gauze pads | Kendall Healthcare | 9024 | |
Cotton applicators | Solon Manufacturing | WOD1003 | |
Saline | Baxter | 281321 | |
10 ml syringe (Luer-Lok) | Beckton-Dickinson | 309604 | |
1 ml syringe (Luer-Lok) | Beckton-Dickinson | 309628 | |
Clippers with #40 blade | Oster | 78005-314 | |
Transpore surgical tape | 3M | MM 15271 | |
Puralube vet ointment | Pharmaderm | not available |